Esta metodologia é significativa na sua vez permite que o método reprodutível e preciso quantifique produtos medicamentos aplicados topicamente usando imagens coerentes de Raman. Outras metodologias fornecem informações farmacocinéticas cutâneas volumosas, enquanto essa metodologia pode fornecer informações farmacocinéticas a granel e microescala, como a rota de permeação de uma droga. As vias de visualização e quantificação e permeação permitirão o desenvolvimento de produtos medicamentosos com um caminho específico em mente para chegar ao local alvo.
A preparação tecidual será a parte mais desafiadora desta metodologia. O tecido deve ser suficientemente fino para que se possa ler através da pele. Para começar a preparação de um tecido de pele de orelha de rato nu, adquira ratos nus eutanizados e remova as orelhas do rato usando fórceps e tesouras microcirúrgicas.
Em seguida, coloque uma orelha em uma grande placa de Petri de tamanho 60 milímetros por 15 milímetros. Em seguida, enxágue a orelha do mouse com PBS duas vezes e bata a orelha seca cada vez com o limpador de tarefas. Se usado dentro de 24 horas, coloque a orelha em PBS em uma pequena placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros a dois a oito graus Celsius.
Para usar após 24 horas de colheita, coloque a orelha em uma placa de Petri sem PBS, em seguida, cubra a placa com parafilme para armazenar em um congelador a menos 20 graus Celsius. Enquanto trabalha sob a capa biológica, coloque o tecido da pele humana em uma grande placa de Petri com o lado estrato corneum voltado para baixo para que a gordura subcutânea seja acessível. Em seguida, use fórceps e tesouras microcirúrgicas para remover a gordura subcutânea.
Uma vez que a gordura subcutânea não pode mais ser removida com a tesoura, use um bisturi descartável de 10 lâminas em um ângulo de 45 graus para a pele para remover a gordura subcutânea restante enquanto segura a pele ainda com fórceps. Quando a gordura for removida, se sectionia a pele humana em um centímetro por pedaços de um centímetro. Para a imagem lipídica, coloque a porção anterior da orelha do rato voltada para o fundo de vidro de um prato de 35 milímetros, número zero.
Para a pele humana, coloque a pele com o estrato corneum enfrentado para baixo para permitir a quantificação da droga do superficial para as camadas mais profundas. Uma vez que o tecido tenha sido centrado na parte inferior do vidro, use um aplicador de ponta de algodão para garantir que a pele é plana e tenha contato completo com a superfície de deslizamento de tampa do prato inferior do vidro. Para evitar qualquer movimento durante a imagem, coloque uma arruela em cima da pele e certifique-se de que o tecido seja visível através do orifício central da arruela para dispersão estimulada de Raman ou detecção de transmissão srs.
Pipeta a dose pré-determinada da formulação na pele, em seguida, use um dedo enluvado para esfregar a formulação no sentido horário por 30 segundos. Após o tempo atribuído para a formulação permear, remova o excesso de formulação antes de colocar a pele com o lado da formulação voltado para o prato de fundo de vidro. Em seguida, prossiga para a configuração experimental ligando o controle de microscópio ou software MC.
Olhando através da ocular, ajuste o foco axial com o botão de ajuste para garantir que o tecido esteja dentro do foco. Quando feito, desbloqueie as vigas da bomba e do Stokes e confirme que os canais ALG1 e ALG2 estão habilitados. Certifique-se de que o fotodiodo SRS está em posição acima do condensador e clique em Focus x2 no software MC para visualizar a pele nos canais CARS e SRS.
No módulo Multi-Area Time Lapse ou MATL, vá para a guia Exibir e clique na Lista de pontos registrados para que a lista de imagens apareça. Uma vez identificado o câneo estrato, role através do foco axial ou foco Z para identificar estratificações específicas do tecido. Profundidades específicas podem ser adicionadas dentro da pele, como corneum estrato, glândulas sebáceas, adipócitos ou gordura subcutânea, conforme determinado durante a imagem ao vivo com contraste lipídudo.
No entanto, se pilhas de profundidade inteiras forem tomadas, as posições XY podem ser adicionadas, e a posição Z relativa pode ser ignorada. No caso de profundidade específica de imagem para cada estratificação da pele, selecione o Ponto de Registro para adicioná-lo à fila MATL. Para obter pilhas de profundidade completas, clique em registrar ponto para cada posição XY com seleção de profundidade na janela Parâmetros de aquisição.
Em seguida, defina o número de repetições para uma no módulo MATL e clique em Pronto. Quando a seta Play mudar de cinza para preto, aperte Play para começar a imagem da pilha de lipídios preliminares. Uma vez que o ciclo de imagem tenha sido concluído, bloqueie os feixes da bomba e de Stokes e altere o comprimento de onda na interface do usuário gráfico laser para o comprimento de onda desejado com base no número de onda alvo ou vibração de Raman.
Ajuste o estágio de atraso de tempo manual, garantindo que os mesmos poderes sejam usados para a imagem do lipídio e do ingrediente farmacêutico ativo ou API que são estabelecidos a priori. Uma vez escolhida a repetição total do ciclo, desbloqueie o feixe da bomba e verifique se a potência corresponde à potência desejada usando o fotodiodo antes de pressionar o Play para iniciar a imagem automatizada dos set points. Em seguida, realize a análise de dados para cada estratificação de pele importando uma imagem lipídica da glândula sebácea em Fiji e verificando os canais Split rotulados pela caixa para dividir o arquivo nos canais CARS e SRS.
Para abrir a Região de Interesse ou Gerenciador de ROI, clique em Analisar, Ferramentas e Gerente de ROI. Usando o canal SRS de tal forma que C seja igual a um, desboche a glândula sebácea na imagem e adicione as marcas ao Gerenciador de ROI clicando em Adicionar T no Gerenciador de ROI. Repita o processo para cada glândula sebácea dentro da imagem.
Para mascarar as regiões ricas em lipídios, selecione cada ROI e clique em Mais, OU Combine e Adicione guias. Para mascarar as regiões pobres em lipídios, use a Ferramenta Retângulo no menu Fiji e desenhe um quadrado em torno de toda a imagem. Adicione a região ao gerente do ROI.
Clique no ROI quadrado recém-adicionado, além do ROI que seleciona todas as regiões ricas em lipídios no ROI Manager. Em More, selecione XOR para gerar uma máscara das regiões pobres em lipídios e adicioná-la ao Gerenciador de ROI. Concatenar as imagens em ordem numérica indo para imagens, pilhas, ferramentas e guias de concatenato em ordem.
Alternativamente, importe as imagens carregando uma em Fiji e, em seguida, selecionando uma opção chamada arquivos do Grupo com nomes semelhantes na página de configuração. Enquanto estiver com a imagem concatenada ativa, vá ao ROI Manager para selecionar as regiões ricas em lipídios e clique na guia Mais antes de selecionar Multi Measure e, em seguida, aguarde que a janela Resultados apareça. A partir da janela Resultados, exporte os dados para uma planilha e adicione uma coluna intitulada Região para adicionar regiões ricas em lipídios a cada linha de dados.
Adicione lipídios pobres a regiões que estavam fora dos lipídios. Para visualizar os dados, salve e importe a planilha em pacote R, ggplot2. Em seguida, plote os dados em função do número de imagem versus intensidade média para estimar os dados de tempo de concentração.
Execute análises não-compartimentais ou NCA em RStudio sobre os dados de tempo de intensidade importados da planilha com a chamada para uma camada. Quando feito, plote e compare visualmente métricas Jmax e AUCflux-all. Além disso, realizar comparações estatísticas em condições experimentais.
A análise representativa retrata estrato corneum, glândulas sebáceas, adipócitos, gordura subcutânea da pele da orelha do rato nu, e estrato corneum, derme papilar e uma glândula sebácea da pele humana. Na pele da orelha do rato nu, o movimento limitado do tecido das glândulas sebáceas foi observado com a mesma profundidade tecidual das glândulas no momento da aplicação da formulação e 120 minutos após a aplicação. O movimento substancial do tecido na pele mostrou glândulas sebáceas pouco visíveis após 120 minutos de aplicação da droga, demonstrando a ineficiência do protocolo original.
Em vários estudos, os perfis de intensidade versus tempo apresentaram altas concentrações iniciais, seguidas pela diminuição das concentrações, indicando não haver mais absorção da droga no tecido. Por outro lado, alguns estudos indicaram um aumento nas intensidades que mais tarde diminuíram ao longo da duração experimental, demonstrando que o fluxo no tecido não havia atingido um máximo antes da imagem. A análise da NCA dos perfis de tempo de concentração de duas formulações para a mesma API indicou que o etoxônio forneceu permeação estendida de API em comparação com a formulação do gel, independentemente da camada de pele.
A análise de exposição total entre as mesmas formulações apresentou observações semelhantes nas camadas mais profundas da pele. A preparação da pele humana e a colocação adequada da pele no prato de fundo de vidro após a aplicação da droga são fundamentais para o sucesso do experimento. As soluções claras aqui demonstraram a adequação dessa metodologia.
Outras pesquisas envolverão formulações comercializadas, como cremes, para compreender como a formulação impacta a penetração e a permeação da API.
