Este protocolo compara as duas técnicas de dispersão raman hiperespectral mais utilizadas, incluindo a dispersão coerente anti-Stokes Raman e os processos estimulados de dispersão de Raman e isso permite que os biólogos escolham a melhor modalidade de imagem para suas aplicações biológicas. Usando as assinaturas vibracionais intrínsecas, a espectroscopia raman coerente é capaz de mapear informações químicas e amostras biológicas sem a necessidade de rotulagem exógena. A microscopia raman coerente expandiu nossa compreensão do metabolismo celular, mapeamento, distribuição de medicamentos, diagnósticos de doenças e quantificação de alterações químicas.
Esta é uma técnica que requer treinamento suficiente tanto em óptica quanto em espectroscopia. Eu recomendaria ler alguns artigos de revisão e ser treinado por um especialista antes de usar essa técnica. Para começar, prepare os slides de imagem colocando um pedaço de fita dupla face em um deslizamento de tampa e corte uma pequena forma retangular da fita do meio da fita para criar uma área aberta para a amostra ser colocada.
Pipeta 1 a 2 microliters de DMSO puro e dispense a gotícula no centro da vaga. Coloque cuidadosamente o deslizamento da tampa superior e coloque delicadamente as bordas dos deslizamentos de cobertura para selar a câmara, certificando-se de que a amostra DMSO não entre em contato com as bordas da fita. Para experimentos de sensibilidade, prepare diluições seriais de DMSO em óxido de deutério para dar uma faixa de concentração de 50 a 0%Pegue 1 a 2 microliters de cada solução e prepare amostras pressionadas como demonstrado anteriormente.
Coloque a amostra no estágio do microscópio e adicione água ou óleo de imersão, se necessário, para a lente objetiva ou condensador. Mova corretamente a borda da gotícula DMSO no campo de visão e ajuste a lente objetiva para o melhor foco, em seguida, centralize o condensador usando o método de iluminação Kohler e abra totalmente o diafragma no condensador. Em seguida, sintonize o comprimento de onda do feixe de bomba para 800 nanômetros para atingir o pico ch3 de 2913 e ajuste a potência da bomba e do feixe de Stokes para aproximadamente 30 miliwatts antes do microscópio, ajustando a placa de meia onda.
Para o SRS, defina o ganho do amplificador de travamento para aproximadamente 10 com uma constante de tempo de 7 microsegundos, garantindo que a constante de tempo seja menor do que o tempo de moradia dos pixels. Defina os parâmetros de aquisição de imagens e o software de aquisição usando um número de pixel de 200 até 200 com o tamanho de digitalização de aproximadamente 100 por 100 micrômetros quadrados, garantindo que a imagem contenha tanto a gotícula DMSO quanto uma área vazia, em seguida, digitalize a amostra e verifique a imagem na tela do computador. Em seguida, escaneie a imagem de atraso motorizada no feixe da bomba de Stokes enquanto monitora as imagens em tempo real e escaneie sobre o atraso até que o sinal seja maximizado.
Mova a gota DMSO para cobrir todo o campo de visão e verifique se a máxima do sinal DC está centrada na imagem, pois o sinal é dependente do feixe de bomba. Ajuste a posição do feixe da bomba através de um espelho ou o deslocamento de tensão no software de imagem. Após a otimização do DC, ajuste os espelhos do feixe de Stokes até que o sinal CA seja maximizado ajustando o valor do limiar para exibir aproximadamente 50% de saturação, verificando se a saturação está centrada na imagem.
Caso não, ajuste os espelhos apenas no feixe Stokes e monitore o sinal durante o alinhamento como feedback em tempo real sobre a qualidade do alinhamento. Para análise SNR, abra o software ImageJ e importe o arquivo de texto de amostra DMSO salvo clicando em Arquivo e, em seguida, Importe, seguido pelas opções Text Image e Open do menu suspenso. Uma vez que a imagem seja importada, pressione o Controle Shift C para trazer a função Brilho e Contraste e pressione o botão Automático na função Brilho e Contraste até que a região da amostra DMSO pareça saturada para encontrar o sinal máximo da amostra.
Em seguida, clique na ferramenta de seleção Oval na interface ImageJ e destaque uma pequena área da região de DMSO saturada. Após o destaque, pressione M para medir a média e o desvio padrão da área selecionada. Para medir o fundo, ajuste as barras na função Brilho e Contraste até que o sinal da região vazia possa ser observado, clique na seleção oval e destaque uma região do fundo, garantindo que a região selecionada não contenha DMSO.
Depois, pressione M para medir as estatísticas da área selecionada. Em seguida, calcule o SNR como demonstrado anteriormente medindo o valor médio de ruído e o valor médio do sinal, juntamente com o desvio padrão. Para processar as imagens CRS hiperespectrais, importe o arquivo de texto clicando em Arquivo, em seguida, Importe, Imagem de Texto e Abra opções do menu suspenso.
Uma vez importado, clique em Imagem, em seguida, Stacks, seguido por opções Ferramentas e Montage para Stack para converter o arquivo em uma pilha de imagens e, em seguida, role através da montagem até que o primeiro pico DMSO seja visível. Selecione uma região no DMSO e clique em Imagem, seguido pelas opções De perfil do eixo Stack e do eixo Z para traçar o espectro de intensidade versus número de quadros. Em seguida, clique em Listar e copie os dados do perfil para extrair os dados espectrais brutos.
Para converter o espectro recuperado em unidades de frequência, realize uma regressão linear utilizando o CH simétrico e assimétrico que se estende do DMSO e seus números de quadro correspondentes. A resolução espectral do DMSO foi medida utilizando-se uma microscopia hiperespectral SRS e CARS, que mostram uma resolução de 14,6 e 17,1 respectivamente, indicando que o SRS possui uma melhor resolução espectral. Os espectros DMSO SRS foram obtidos em concentrações de 0,1 e 0,01%, nas quais o pico de 2913 pode ser resolvido no primeiro, mas não no segundo, indicando que o limite de detecção está entre 0,1 e 0,01% DMSO.
Os espectros de CARS recuperados em fase mostram que o pico de número de ondas DMSO 2913 pode ser claramente resolvido para o DMSO de 0,1%, mas não o 0,01% que indica um limite de detecção entre essas duas concentrações. Os perfis de intensidade srs e cars de uma célula MIA PaCA-2 demonstraram que o sinal SRS deu uma resolução de 398,6 nanômetros, enquanto o sinal CARS deu 1,2 vezes melhor resolução de 330,3 nanômetros. As imagens SRS e CARS das células MIA PaCa-2 em diferentes posições de atraso óptico mostram os sinais mais fortes com gotículas lipídicas como pontos brilhantes para SRS, enquanto os CARS têm contrastes muito reduzidos.
No entanto, uma mudança vermelha de 37 ondas no foco espectral melhorou os contrastes lipídes para srs e CARS. Os espectros srs mostram um sinal muito mais forte em 2850 número de ondas para gotículas lipídicas do que outras organelas, enquanto os espectros CARS mostram uma pequena mudança vermelha. Para otimizar o sinal de dispersão raman coerente, primeiro encontre o foco da amostra, depois ajuste o atraso óptico e, finalmente, ajuste os espelhos até que um máximo seja alcançado.
Outras tecnologias de sonda de bomba, como a absorção transitória, são inerentemente integradas à plataforma CRS. Esta tecnologia é muito poderosa para medir a cinética de absorção de luz forte absorvendo moléculas não fluorescentes. Essa técnica permite que os pesquisadores visualizem pequenas moléculas de forma livre de rótulos com alta atividade celular química.
Também permite que os pesquisadores visualizem mudanças no metabolismo lipídico, dinâmica intracelular e distribuição de medicamentos.
