Nos últimos anos, o encapsulamento dentro de vesículas de bicamadas lipídicas do tamanho celular provou ser um método útil para experimentos de reconstituição in vitro. O método que apresentamos ajudará muito na reconstituição do citoesqueleto na pesquisa de células sintéticas. Com este método, podemos gerar vesículas unilamellar gigantes de tamanho heterogêneo com alto rendimento.
O tempo de geração de vesículas é significativamente reduzido em comparação com a técnica cDICE convencional. Podemos encapsular sistemas de tradução de transcrição sem células isolados de processos celulares complexos e simultaneamente que ocorrem para examinar vias moleculares. Este método pode ser utilizado para montar protocéulas mínimas para a criação de células sintéticas funcionais.
Comece a preparar uma mistura óleo-lipídico transferindo dioleoyl-fosfocolina, colesterol e rhodamina PE para um frasco de vidro de 15 mililitros. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de clorofórmio no frasco. Pipeta 7,2 mililitros de óleo de silicone e 1,8 mililitros de óleo mineral em um tubo separado de 15 mililitros e misturar os óleos por vórtice a uma velocidade de 3.200 rotações por minuto durante 10 segundos.
Em seguida, adicione a mistura de óleo ao frasco contendo a mistura lipídica e clorofórmio e o vórtice da mistura à velocidade de 3.200 rotações por minuto durante 10 a 15 segundos até que a mistura lipídica-em-óleo resultante esteja ligeiramente nublada, pois os lipídios não são totalmente dissolvidos no óleo. Em seguida, sonicar o lipídio na dispersão de óleo em um sonicator de banho com potência ultrassônica de 80 watts e uma frequência operacional de 40 kilohertz por 30 minutos à temperatura ambiente. Se não for usado imediatamente, armazene a mistura lipídica-óleo a quatro graus Celsius por 24 horas.
Para gerar as vesículas, use o conjunto com um eixo impresso em 3D feito de resina preta montada na placa de agitação do banco à velocidade de 1.200 rotações por minuto. Em seguida, monte o encapsulamento de cruzamento contínuo da interface de gotícula impresso em 3D, ou câmara cDICE, feita a partir da resina clara no eixo de resina preta. Prepare a solução de actina de 1 a 10 micromolar no buffer globular actin, ou buffer G, incluindo actin 10%ATO 488.
Para iniciar a polimerização de actina, adicione o tampão de polimerização de actina fiotos, ou tampão F, na solução actin no gelo e, em seguida, mantenha as soluções no gelo para retardar a polimerização da actina antes de adicionar um crosslinker. Para preparar as proteínas de ligação de actina, ou ABPs, a partir de 1,75 miligramas por mililitro de caldo de fascina, aliquot 1,57 microliters de fascina em um microtubo separado. Em seguida, adicione 7,5% do gradiente de densidade na solução actin para criar um gradiente de densidade entre a fase externa e aquosa interna e facilitar vesículas unilamellar gigantes ou GUVs, sedimentação.
Em seguida, dispense 700 microliters de glicose de 200 mililitros como a solução externa para a câmara. Adicione bastante mistura de óleo lipíduo na câmara até que 60% a 80% da câmara esteja cheia. Uma interface será formada entre a mistura lipída-óleo e a solução externa.
Prepare uma mistura actin-ABP transferindo ABPs para a solução actin. Em seguida, use uma pipeta regular de 100 a 1.000 microliteres para transferir os 700 microliters da mistura lipídica-óleo para a mistura actin-ABP. Pipeta para cima e para baixo oito vezes para gerar gotículas de emulsão de monocamadas lipídicas do tamanho celular com um diâmetro de 7 a 100 mícrons.
Use a mesma pipeta de 100 a 1.000 microliter para distribuir toda a emulsão na câmara rotativa. As gotículas adquirirão um segundo folheto de lipídios cruzando a monocamada lipídica na interface da solução óleo-exterior, formando ASSIM GUVs. Quando terminar, retire a câmara da placa de mexida e descarte a maior parte da mistura lipídica-óleo inclinando a câmara no recipiente de resíduos.
Segurando a câmara com a tampa voltada para dentro, abra a tampa da câmara e incline ligeiramente a câmara para dentro. A interface entre a solução externa contendo GUVs e a mistura lipídica-óleo será visível a partir da abertura da câmara onde a tampa está localizada. Use uma pipeta para coletar solução externa suficiente contendo GUVs e dispensar 50 a 300 microliters da solução externa em uma placa de 96 poços para obter uma densidade adequada de GUVs.
Para a imagem dos GUVs, configure a placa de 96 poços no palco de um microscópio invertido equipado com uma lente objetiva de imersão de óleo 60X. Abra uma sequência de imagem de interesse em um software de processamento de imagem, ImageJ Fiji, e identifique a imagem com a maior intensidade. Segure o Controle shift C para abrir a janela de brilho e contraste e clique na guia de reset.
No menu ImageJ Fiji, vá para as guias Analisar e Definir escala para inserir a distância física e unidade conhecidas para cada pixel de imagem. Uma vez feito, vá para os botões Imagem, Stacks e, em seguida, 3D Project para reconstruir uma imagem 3D da pilha Z. Defina o método de projeção como ponto de brilho, corte o espaçamento como 0,5 micrômetros e, em seguida, marque a caixa Interpolate.
Use as opções padrão para o resto das configurações e capture imagens. A imagem representativa mostra uma imagem confocal de GUVs rotulados por Rhodamine PE com feixes encapsulados de fascin-actin. A transferência das proteínas de ligação actina para a solução actin, em seguida, a adição de mistura lipídica-óleo e a geração de gotículas de monocamadas lipídicas devem ocorrer em poucos segundos para evitar a formação de redes actinas antes do encapsulamento.
Usamos esta técnica cDICE modificada para examinar os papéis de diferentes transfronteiriços de actin net na organização de redes actin. Esperamos que este método ajude outros pesquisadores a explorar a regulação de outras proteínas citoesqueletos.
