O objetivo geral deste procedimento é monitorar mudanças nas concentrações citosóicas de cálcio em células vivas para diferenciar respostas neuronais ou glia com base em cloreto de potássio, ou estímulos ATP. O cálcio é um importante segundo mensageiro envolvido em vários processos celulares, incluindo neurotransmissão, plasticidade e apoptose. O advento do corante de cálcio fluorescente de alta resolução, como o Fura-2 AM, associado ao desenvolvimento de melhores microscópios fluorescentes e métodos de computação, produziu dados ópticos de alta resolução com alto grau de resolução espacial e temporal para a sinalização de cálcio de imagem em células e organismos vivos.
Este protocolo é adaptável a neurônios enriquecidos, glia purificada ou culturas populacionais mistas. Ele rastreia quais tipos de células responderam a estímulos determinantes com base na resposta diferencial ao cloreto de potássio e ATP. O potencial de membrana da célula de alteração do cloreto de potássio.
E isso abre canais de cálcio fechados de tensão, expressos essencialmente por neurônios. Por outro lado, a ATP ativa o canal P2X7 em grande parte, presente principalmente em células gliais. Ao acoplar cloreto de potássio e estímulos ATP com outras drogas, é possível ver qual compartimento do sistema nervoso está respondendo a eles, com base no aumento da concentração de cálcio intracelular.
Para este procedimento, você precisará de alguns instrumentos cirúrgicos ou pinças. Use um armário de biossegurança e realize as melhores práticas para evitar contaminação. Para iniciar a cultura da retina de frango, abra cuidadosamente um óvulo fertilizado pelo fundo, onde a célula de ar está localizada.
Remova o conteúdo para uma placa de Petri e proceda com a doação de embriões por decapitação com um par de pinças. Uma vez que a cabeça é removida, leve-a para uma placa de Petri limpa e adicione um pouco de solução livre de cálcio e magnésio a ela. Em seguida, remova os olhos, tomando cuidado para não danificá-los no processo.
Leve o olho para outra placa de Petri contendo solução CMF. Com um par de pinças, comece a dissecar o olho removendo a lente. Em seguida, começando pelo orifício deixado pela lente, faça três ou quatro cortes longitudinais no olho.
Remova o corpo vítreo transparente com cuidado. Certifique-se de que a retina não está se ligando a ela. Em seguida, desprende suavemente a retina do epitélio pigmentado.
Remova qualquer tecido epitelial restante. Quando a retina estiver totalmente clara, corte-a em pequenos pedaços. Pegue todo o tecido da retina com a ajuda de uma pipeta automatizada.
Centrifufique brevemente a retina para remover todo o CMF. Adicione 1 mL de 0,25% de trippsina. E incubar o tecido a 37 C por 10 minutos.
Pare a reação de trippsina adicionando 1 mL de meio contendo soro de bezerro fetal de 10%. Centrifugar a retina para remover toda a trippsina. Lave as células duas ou três vezes com meio contendo 10% DE FCS.
Em seguida, adicione 2 mL de médio por retina e dissocia-o suavemente mecanicamente. Diluir as células para que você possa contá-las adequadamente com um hemótmetro. Use tampas de 15 mm protegidas com poli-L-lisina e laminina para ajudar a adesão celular.
Pipeta 50 L de suas células diluídas em cada deslizamento de cobertura. Incubar as células a 37 C em atmosfera de CO2 de 5%. E esfriá-los para anexar o vidro.
Isso deve levar cerca de uma a duas horas. Adicione 1 mL de meio e devolva-o à incubadora até o dia do experimento. Se necessário, troque metade do meio a cada dois ou três dias.
Reconstitua um frasco de 50 g de Fura-2 AM com 50 L de DMSO. A solução krebs é uma boa opção para transferir células durante o experimento, porque não interfere na medição da fluorescência. Pré-aqueça a solução para 37 antes de começar.
Adicione Poloxamer 407. Adicione Fura-2 AM e DMSO. Sonicate-lo por sete minutos em um banho de água.
Prepare uma placa de 6 poços adicionando solução Krebs a três poços e a solução Fura-2 em funcionamento em outro. Lave a tampa conter suas células três vezes antes de adicionar ao poço Fura-2. Incubar as células a 37 C e 5% de CO2 atmosfera por 30 minutos em uma incubadora escura.
Depois da incubação, lave-o três vezes novamente. Transfira para outro destinatário contendo Krebs e proteja-o da luz. É possível reutilizar o Fura-2 preparado para incubar mais tampas com células.
Adicione silício ao suporte de deslizamento de tampas e câmara antes de cada corrida para evitar vazamentos da solução. Retire o deslizamento da solução Krebs e lave cuidadosamente o fundo com água destilada para evitar a cristalização do sal na lente do microscópio. Coloque o deslizamento de cobertura no suporte, pressionando as bordas com cautela.
Conecte o suporte de deslizamento de tampas e a câmara ao microscópio e comece a perfundar as células com a solução Krebs. Selecione células apropriadas e escolha um bom campo. Determine manualmente as regiões de interesse selecionando corpos celulares com base em sua morfologia distinta.
As variações da concentração de cálcio foram avaliadas quantificando a razão da fluorescência emitida em 510 nm após excitação alternativa em 340 e 380 nm. Depois de adicionar cloreto de potássio é possível ver muitas células brilhando e a resposta de fluorescência aumentando no gráfico. Cloreto de potássio abre canais de cálcio fechados de tensão, apresenta-se principalmente em neurônios.
Cada linha individual no gráfico representa a única região de interesse. Portanto, é possível rastrear respostas celulares individuais durante o experimento. Estímulos ATP abre receptor P2X7, essencialmente expresso por células gliais.
Esta é uma cultura de neurônios enriquecida. Portanto, há poucas células gliais aqui. Esta é a razão pela qual tão poucas células respondem aos estímulos ATP.
Os valores adquiridos foram processados utilizando-se o software Metafluor. Os resultados experimentais são expressos em uma tabela Excel, onde cada linha representa uma célula individual, e cada linha, um ponto de tempo. Usando o software Excel, é possível traçar variações de cálcio de células individuais separadamente, ou de todas elas no mesmo gráfico.
Para quantificar a quantidade de células reativas a qualquer estímulo, defina um corte de 30% nos níveis de linha de base de cálcio. Aqui usamos células de retina na cultura a partir de filhotes embrionários do dia 8 para investigar como os neurônios e o sinal de glia em termos de mudanças de cálcio, depois de receber 50 mm de cloreto de potássio e 1 mm de estímulos ATP. Em cada experimento, cerca de 100 células foram prontamente analisadas.
A Figura A representa uma cultura mista contendo neurônios e glia, que foi mantida por uma semana. Quando quantificamos as respostas, é possível ver que cerca de metade das células analisadas respondem cloreto de potássio, e a outra metade respondeu à ATP. A figura B refere-se a uma cultura enriquecida por neurônios.
Foi incubado por apenas três dias, portanto, a maioria das células gliais ainda não se diferenciaram. Neste caso, 89% das células respondem cloreto de potássio, reforçando a prevalência de neurônios. A Figura C mostra uma cultura glia purificada.
Essas células foram mantidas por 10 dias com alterações médias a cada três dias. Depois desse tempo a maioria dos neurônios morre, deixando apenas glia. De fato, essa cultura foi ativada exclusivamente pela ATP.
Essa metodologia tem sido amplamente utilizada devido às propriedades universais do cálcio como segundo mensageiro. A análise fenotípica pode ser aprimorada complementando essa metodologia com a imunoquímica das células fixas após a imagem de cálcio. Este protocolo também poderia ser adaptado a outros sistemas de células mistas que expressam outros canais de cálcio.
A dica importante é encontrar respostas seletivas de diferentes tipos de células correlacionadas com sua expressão fenotípica.
