Este trabalho foi suportado por concessões do NIH (DC007681, AB), Caule CT celular concessão (AB), fundação Pardee (AB), predoctoral Ruth L. Kirschstein Nacional de Pesquisa Serviço de Prêmios (NRSA) (SZY), e um NSF Graduate Research Fellowship (BL). Agradecemos aos membros do laboratório Bordey pelos comentários úteis sobre o manuscrito. O presente material é baseado em trabalho, em parte suportado pelo Estado de Connecticut sob o Stem Cell Research Connecticut Programa de Subsídios. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Estado de Connecticut, o Departamento de Saúde Pública do Estado de Connecticut ou CT Innovations, Incorporated.

1. Preparação de Soluções, dissecação, e Vibratome <ol><li> As soluções devem ser preparadas no osmolaridade correta e pH (Tabela 1). Comparado com fluido cerebrospinal artificial (ACSF), solução de dissecção é preparado com menores concentrações de sódio e de cálcio, e as concentrações mais elevadas de magnésio. Isto é para minimizar os efeitos de excitotoxicidade, durante o corte. </li><li> Ambas as soluções de dissecção e ACSF deve estar saturado com 95% O2 / 5% de CO 2 por borbulhamento durante pelo menos 10 minutos para atingir o pH desejado de 7,3. </li><li> Preparar um banho de gelo em uma bandeja. Colocar uma placa de dissecação no banho de gelo e encher com solução de dissecção. Bolha da placa de dissecação. </li><li> Prepare o vibratome criando um banho de gelo. Coloque o recipiente de corte, em banho de gelo, encher a placa com solução de dissecção, e bolhas. </li><li> Preencha a fatia segurando câmara com ACSF e bolha para garantir que a solução é uma aeração, independentementede onde pedaços são colocados. </li></ol> 2. Remoção do Tecido Cerebral Fatias cerebrais agudas tendem a ser mais saudáveis ​​com ratos mais jovens. Arquitetura celular do SVZ pós-natal em roedores é maduro por volta do dia pós-natal (P) 20 1. Por isso, tentamos limitar nossas experiências para idades rato da P20-P30, mas temos realizado experiências bem sucedidas em camundongos mais velho que 3 meses. Durante todo o manuseamento do tecido, deve-se ter o cuidado de minimizar movimentos mecânicos e de pressão para o cérebro, manter as condições de refrigeração, e expõe o SVZ a solução tão rapidamente quanto possível sacrifício seguinte. <ol><li> Após a injeção de pentobarbital, o mouse é rapidamente decapitado. A pele é removida e são feitas incisões através da base do crânio. A cabeça é então colocado num tabuleiro cheio com solução de dissecção. </li><li> Enquanto a estabilização da cabeça com uma pinça, cortes contínuos são feitas em torno do crânio e às vezes até a linha média com Microscissors. Tenha cuidado para minimizar o contato com o tecido. Desde o bulbo olfativo é o destino final de neurônios do SVZ, deve-se estar consciente de preservar essa região, especialmente durante a remoção do osso em torno desta área. Cortes Microscissor feitos em torno do crânio deve estar no lado dorsal, para permitir a fácil remoção do crânio. </li><li> A remoção do crânio que cobre o cérebro está agora separada do osso por debaixo do cérebro. Se os cortes na etapa anterior são feitas corretamente, este osso sobrejacente pode ser facilmente removido com uma pinça ou fórceps. </li><li> Continuando a manter a cabeça com uma pinça, pode-se utilizar uma lâmina cirúrgica para remover de forma limpa várias peças de tecido do cérebro anterior de corte, tais como as seguintes. Um corte coronal pode ser feita ao nível do lambda. Cortes sagitais podem ser feitas em ambos os lados do cérebro lateral à SVZ. Uma estimativa conservadora seria ~ 2,5 mm da linha média. Se desejado, o cérebro pode também ser hemisected aqui. Estes cortes serão ambos facillite montagem do tecido e permitir que o SVZ a ser alcançado mais rapidamente, quando o corte do cérebro. É importante lembrar que exercem a quantidade mínima de forças mecânicas sobre o cérebro (por exemplo, não empurrando ou puxando). </li></ol> 3. Preparação Slice aguda Cérebro <ol><li> Para se preparar para as etapas subsequentes, assegurar que a super-cola usada para montar o tecido está livre de obstruções e pronto a ser aplicado à placa de vibratome. É importante ir tão rápido quanto possível, sem danificar o cérebro. </li><li> O tecido do cérebro pode então ser esvaziado por baixo, o que separa o tecido do osso subjacente ao mesmo tempo que separa os nervos. </li><li> O tecido é montada e colada sobre uma placa e colocadas no vibratome. Devido à anatomia do rostro-caudal da SVZ, temos focado em fazer cortes sagitais em que preserva a via migratória de neuroblastos, a bainha da glia, e a vasculatura que são em grande medida alinhadas neste sentido. Um pode mount o tecido na linha média ou sobre a superfície plana criado fazendo cortes sagitais laterais ao SVZ. Um passo opcional é colocar um bloco de 3% de agarose por trás do tecido para servir como um encosto para a lâmina como as fatias de sair. Nós preferencialmente utilizados cianoacrilato cola à base de super. </li><li> Enxaguar a lâmina com etanol para remover óleos e lavar com água destilada. Colocar a lâmina sobre o suporte da lâmina. Monte o suporte da lâmina para o vibratome. </li><li> Ajustar as definições Vibratome para cortar o tecido com uma espessura de 250-350 mM por fatia. É importante para cortar utilizando vibrações de alta frequência e baixa velocidade. </li><li> Secção progressivamente através do tecido. A aparência do bolbo olfactivo é um bom indicador de que se está perto do SVZ em cortes sagitais como as fatias mais laterais irá conter nem a região. Outros marcos de olhar para incluir o ventrículo eo espessamento do corpo caloso, sob o qual o SVZ está localizado. A SVZ aparecerá primeiro em mais sagit lateraisfatias mentais. O RMS vai mostrar em medial cortes sagitais. </li><li> Remover fatias contendo o SVZ com uma pipeta de Pasteur de plástico com ponta cortada. Transferindo-se para a câmara de realização fatia. Nós muitas vezes obter mais fatias do que podemos usar em um dia de trabalho. No entanto, as fatias irá variar a quantidade de células que contenham a SVZ. Por vezes, é necessário olhar através de várias fatias de encontrar um desejado para a imagem latente. </li></ol> 4. Preparação de microscópio e Corantes As fatias de exigir um tempo de incubação de uma hora em ACSF a recuperar da dissecção e corte. Várias etapas podem ser realizadas durante este período de recuperação de fatia. <ol><li> Preparação de pipetas para a tintura de cálcio e / ou a aplicação de drogas <ol class="lalpha"><li> Pipetas de vidro precisam de ter uma ponta de 2-3 um de diâmetro e um comprimento de ponta (~ 2 mm) eo ângulo (~ 16 ° para o detentor pipeta) que evita o contacto com a câmara de perfusão e permite espaço para a colocação deo objetivo. </li><li> Pode-se preparar tipicamente 6-8 pipetas de pressão para cada dia de experiências. </li></ol></li><li> Preparação corante cálcio <ol class="lalpha"><li> Quando se prepara a solução de trabalho (4-5 uM de banho, 250 uM por aplicação de pressão), é melhor para expor a quantidade mínima de DMSO para as células. Isto pode ser conseguido, fazendo stocks altamente concentradas. Por exemplo, para Fluo-4, um tubo contendo 50 ug por dia é utilizada. Pode-se fazer um estoque de 10 mM de esta aliquota por adição de 4,6 uL de solução de Pluronic F-127 a 20% em DMSO. </li></ol></li><li> Preparando a configuração microscópio (Figura 2). <ol class="lalpha"><li> A utilização de uma bomba peristáltica, para o fluxo de solução tem ajudado a minimizar o desvio da imagem. Fazer funcionar a bomba peristáltica antes de permitir ACSF a correr através das linhas de perfusão e de assegurar que seja livre de bolhas. </li><li> Defina a entrada do tubo na câmara de perfusão e garantir que não haja vazamentos. </li><li> Posicione a ponta de vácuo para ensgurar que a solução está a ser aspirada a partir da câmara de perfusão. Garantir que ele está em um nível adequado para que o objetivo está imerso a uma distância adequada de trabalho, mas não tão alto como solução que pode transbordar da câmara. Um nível baixo de solução também irá minimizar as distorções de fluxo. A aspiração constante também pode ser verificada por escuta para estabilidade. </li></ol></li></ol> 5. Carregando Dye Este método tem sido descrito em detalhe em outro manuscrito 2. Por favor, veja as figuras nele. <ol><li> Corante de carga de banho <ol class="lalpha"><li> Prepare uma solução de trabalho 1-2 ml do corante. Para Fluo-4 AM, uma concentração de 4-5 mM é adequado para etiquetar neuroblastos SVZ. </li><li> Fatias são primeiramente transferidos para uma placa de cultura de 35 mm com uma parte inferior de malha que já está preenchida com ACSF. Substituir a solução por meio de uma pipeta de transferência de 3 ml de plástico para remover suavemente a ACSF e, simultaneamente, adicionando a calcium corante de solução de trabalho. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30-60 min num ambiente de 5% de CO 2 do gás controlada. </li><li> Colocar a fatia de volta para a câmara cheia de ACSF segurando para lavar corante que não tenha entrado células. Alternativamente, pode-se colocá-lo directamente na câmara de perfusão microscópio que está a executar ACSF. Este período de lavagem de 30-45 minutos. </li><li> Transferir a fatia para a câmara de perfusão. </li></ol></li><li> A aplicação da pressão de corante <ol class="lalpha"><li> Transferir a fatia a partir da câmara de retenção para a câmara de perfusão da configuração microscópio. </li><li> Encha uma pipeta de vidro com uma solução de trabalho que é de 250 uM e local sobre o micromanipulador. </li><li> Diminuir a pipeta para a região de interesse. A pipeta pode ser colocada de tal modo que a ponta é ou vários micrómetros acima da superfície da fatia ou vários micrômetros enterrado abaixo da superfície da fatia, mas longe da região gravada. O ângulo da pipeta não Affect a eficiência de carga. Quando imagem abaixo da superfície da fatia, descobrimos que colocar a ponta da pipeta abaixo do plano de imagem irá rotular nossa área de imagem desejada melhor. </li><li> Quando a pressão de aplicação do corante, defina a Picospritzer de modo que é &lt;3 psi. Não foram estimar o volume de difusão do corante, porque este é sujeito a variabilidade do diâmetro da ponta da pipeta, a pressão aplicada e a densidade do tecido, onde o corante é injectado. Nós simplesmente aplicar até alcançarmos nossa carga desejado, tal como avaliado por olho. Minimizar os danos para a fatia durante a aplicação, especialmente quando a extremidade é colocada por baixo da superfície de corte. Aplicar por 1-2 min. Às vezes repetidas aplicações são necessárias dependendo rotulagem avaliada por olho. Para esta aplicação e duração de concentração, descobrimos que a aplicação superficial de corante preferencialmente rotula neuroblastos enquanto abaixo da superfície de aplicação, preferencialmente, rotula astrócitos. No entanto,&gt; aplicação min 3 a 500 uM também irá etiquetar neuroblastosindependentemente do facto de a ponta está acima ou abaixo da superfície da fatia (JC Platel, observação não publicada). Permitir a lavagem e recuperação fatia por 30-45 min. </li></ol></li></ol> 6. Imagem confocal de Atividade de cálcio <ol><li> Encontrar a região de interesse pela primeira vez com um objetivo de baixo consumo, como 4x ou 10x. Coloque no centro do campo antes de mudar para um objetivo maior potência. Neste ponto, pode-se avaliar a saúde geral fatia notando o aparecimento de células SVZ sob contraste de interferência diferencial (DIC). As células saudáveis ​​aparecem rodada e gordo. Além disso, as células saudáveis ​​que exibem fraca Fluo-4 carregamento como suposto nenhuma carga na fluorescência total ou brilhante (uma célula a morrer). </li><li> Abaixe o objetivo imersão em água para a região de interesse, que agora é corante-carregado. Ou um objectivo 40x ou 60x tem sido adequado para as nossas necessidades, apesar de 40x proporciona um maior campo de visão e permite um acesso maior pipeta. Quando abaixo da imagiologiasuperfície, que muitas vezes passam pelo menos 15 mm abaixo da superfície da fatia onde a arquitetura 3-dimensional e saúde célula são melhor preservados. </li><li> Verifique se a perfusão e vácuo estão trabalhando adequadamente. </li><li> Configurar o microscópio para que a resolução de lapso de tempo e resolução espacial são definidas para as taxas desejadas. Para a microscopia confocal, estes factores devem ser equilibradas, como um aumento da resolução temporal geralmente resulta em uma perda de resolução espacial devido à natureza do sistema de digitalização. Para a atividade de cálcio, nós ter imaginado um quadro de aproximadamente a cada segundo com uma resolução de pixel 512x512. Se múltiplos canais adquiridos separadamente são necessárias, isso também vai afetar as taxas de aquisição. Definir a duração do filme (2-10 min). </li><li> Iniciado executado. Se realizar estudos farmacológicos, lave em antagonistas ou não dessensibilizantes agonistas por pelo menos 5-10 minutos, e depois fazer outro filme de 5-10 min. Agonistas que podem dessensibilizar os receptores podem ser aplicadas de forma aguda, por exemplo, usando um prEssure pipeta controlada por um micromanipulador. </li></ol> 7. Análise de cálcio Análise segue os procedimentos padrão que se descritos nas publicações permeáveis ​​2-4. F 0 (linha de base, por exemplo) e F são as intensidades de fluorescência médios medidos ao longo de todas as regiões de interesse (ROI) e em cada uma ROI, respectivamente. A alteração de fluorescência foi considerado como sendo um aumento de Ca2 + se foi&gt; 15% F / F aumento 0. Intracelulares de Ca 2 + variações foram calculadas utilizando Calsignal 5. 8. Resultados representativos Fomos capazes de obter carga selectiva de células SVZ dependendo dos protocolos de carga de corante descrito acima e noutros locais 2-4,6. Carregamento banho ou a aplicação de pressão sobre a superfície da fatia de Fluo-4 AM (4-5 ou 250 uM, respectivamente) na sua maioria etiquetas neuroblastos. Embora a aplicação de pressão pode carregar neurobdura mais rapidamente do que o carregamento banho em uma única fatia, carregamento banho permite o carregamento simultâneo de várias fatias. Confirmamos a identidade de células marcadas como neuroblastos por (1) se eles exibem um comportamento migratório 4,7, (2) a sua morfologia, (3) coloração negativa de sulforrodamina 101, um corante específico dos astrócitos-3 ou (4), com coloração positiva DCX-DsRed expressão (JC Platel, observação não publicada). Neuroblastos migrar rapidamente (média de 60 um / h) a temperatura fisiológica 4,7-9, mas o seu movimento pode ser facilmente observada mesmo à temperatura ambiente. O movimento de neuroblastos não representar um problema com relação à colocação de regiões de interesse (ROI) para controlar a atividade de cálcio uma vez que nossos filmes são geralmente de curta duração. No entanto, durante longos períodos de espera, como durante os intercâmbios de soluções de drogas, os investigadores devem ter o cuidado de combinar ROIs no controle e períodos de tratamento. Não é incomum para neuroblastos para migrar para dentro ou para fora do i<html> maging campo ou plano focal. A aplicação da pressão de Fluo-4 AM (250 M) em profundidade a fatia e de duração limitada (&lt;2 min) preferencialmente rotula astrócitos SVZ 2. Rotulagem astrócito foi verificada por meio de rotulagem positiva com sulforrodamina 101 e a sua morfologia, principalmente pela presença de projecções e endfeet sobre os vasos sanguíneos que foram recentemente descritas 3. Usando estes métodos, temos observado actividade espontânea em ambos os neuroblastos SVZ e população de astrócitos (Figura 1). A atividade em astrócitos muitas vezes toma a forma de ondas que se dedicam 3 vaso sanguíneo. Além disso, utilizando imagiologia de cálcio como um ensaio, a aplicação de agonistas farmacológicos revelou ou confirmou a expressão de receptores GABA A de neuroblastos e astrócitos 6, os receptores AMPA e NMDA em neuroblastos 4. Figuras 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Propagação da atividade de cálcio em astrócitos. (A) Representante média imagem de uma gravação de lapso de tempo de atividade de cálcio. Os astrócitos do SVZ foram carregadas com a aplicação da pressão de Fluo-4:00 profundamente na fatia. Filmes foram adquiridos a 0,75 s de tempo-passos. As regiões de interesse (ROI) são colocados sobre as células que exibem actividade. (B) Vestígios de ROIs colocados sobre as células do filme descrito em (A). Traços foram filtrados com uma média móvel e normalizado. A escala vertical representa 2 x Af / F 0 onde F é a intensidade de sinal e F 0 é o sinal de linha de base média e Af = FF 0. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4071/4071fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem do sistema de perfusão. Uma extremidade de um tubo está submersa em 95% de O2 / 5% de CO 2 gás-perfused solução. A solução é então perfundido através do tubo e para a câmara de banho através de uma bomba peristáltica (não mostrada). A outra extremidade está inserida dentro da entrada da câmara de solução de banho montado sobre uma plataforma. A ponta de aspiração é então ligado à tomada de solução da câmara, e fixado a um nível para determinar a altura da solução. Da tomada, a ponta de aspiração está ligado à linha de vácuo, que aspira a solução a partir da câmara para um recipiente de resíduos. O sistema de perfusão é mostrada fora da platina do microscópio para claridade visual.

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	<li>Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+formation+and+glial+tube+assembly+in+the+shift+from+neonatal+to+adult+subventricular+zone+of+the+rodent+forebrain.">Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain.</a> J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).</li><li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice.">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).</li><li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Imagiologia de cálcio de células SVZ tem sido utilizada para estudar os padrões de actividade espontânea em 10 neuroblastos, expressão de receptores de canal em ambos os neuroblastos e astrócitos 4,6,8 e ondas de cálcio astrocíticos 3. Uma vez que as células no SVZ ou são imaturos ou têm propriedades gliais, eles não são acionados acção potenciais 11,12, o que significa que alterações no potencial de voltagem milissegundo indicativos de actividade em redes mad...

<table border="1"><tbody><tr><td> Soluto </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Dissecção (mM) </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td> Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td><td> Dissecção: 42 mm ACSF: 126 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td><td> Dissection: 2,5 mM ACSF: 2,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 .6 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M9272 </td><td> Dissecção: 4,33 mM ACSF: 1 mM </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4. H 2 O </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td> Dissection: 1,25 mM ACSF: 1,25 mM </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td><td> Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S6014 </td><td> Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td><td> Dissection: 1,33 mM ACSF: 2 mM </td></tr></tbody></table> Tabela da lista de Química 1. Receitas e de solução de dissecção e ACSF. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> [Header] </td></tr><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT 1000S </td><td></td></tr><tr><td> Super Glue </td><td> Surehold ou 3M </td><td> Surehold 3G Super Cola ou 3M Vet-Bond </td><td></td></tr><tr><td> Instrumentos de dissecação </td><td> Roboz ou Ted Pella </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluo-04:00 cálcio-corante sensível </td><td> Invitrogen </td><td> F14201 </td><td></td></tr><tr><td> Verde Oregon-BAPTA 01:00 cálcio-corante sensível </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de Pluronic F-127 a 20% em DMSO </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio confocal vertical </td><td> Olimpo </td><td> FV300 ou FV1000 </td><td></td></tr><tr><td> Imersão em água objetivos </td><td> Olimpo </td><td> LUMPlanFl 40 x W / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W / I (NA 0,90) </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipuladores </td><td> Sutter </td><td> MPC-200/MPC-325/MPC-385 </td><td></td></tr><tr><td> &lt;Controlador de pressão/ Td&gt; <td> Parker Hannifin </td><td> Picospritzer </td><td> &lt;3 PSI durante a aplicação </td></tr><tr><td> Pipeta extrator </td><td> Sutter ou Narshige </td><td> Sutter P-97 ou Narshige PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas de vidro </td><td> Sutter </td><td> BF150-110-10 </td><td> ID: 1,10, OD: 1,50 </td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modelo 720 </td><td> taxa de fluxo: 1 ml / min </td></tr><tr><td> Banho de Câmara </td><td> Warner Instruments </td><td> RC-26 GLP </td><td> De baixo perfil permite folga objetivo </td></tr><tr><td> Tubulação </td><td> Tygon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Controlador de temperatura </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-324B/344B </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2. Materiais / lista de equipamentos.

preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging

A zona subventricular (SVZ) é uma das duas zonas de origem neural no cérebro pós-natal. A SVZ contém células densamente, incluindo as células progenitoras neurais com características astrocíticos (chamados astrócitos SVZ), neuroblastos e células progenitoras intermediárias. Neuroblastos nascidos no SVZ tangencialmente migrar uma grande distância para o bulbo olfativo, onde se diferenciam em interneurônios. Sinalização através de moléculas de adesão intercelular e sinais difusíveis desempenham papéis importantes na neurogênese de controle. Muitos destes sinais de desencadear a actividade do cálcio intercelular, que transmite a informação dentro e entre as células. Actividade de cálcio é, portanto, reflexo da actividade de sinais extracelulares e é uma forma optimizada para compreender sinalização intercelular entre as células SVZ funcional. Actividade de cálcio foi estudada em diversas outras regiões e tipos de células, incluindo os astrócitos maduros e os neurónios. No entanto, o método tradicional de loacélulas D com cálcio indicador corante (ou seja, carga banho) não foi eficiente no carregamento de todos os tipos de células SVZ. De facto, a densidade celular no SVZ impede a difusão do corante dentro do tecido. Além disso, a preparação de cortes sagitais será melhor preservar o arranjo tridimensional de culas SVZ, particularmente o fluxo de migração dos neuroblastos no eixo rostral-caudal. Aqui, descrevemos métodos para preparar secções sagitais contendo o SVZ, o carregamento de culas SVZ com corante indicador de cálcio, e a aquisição da actividade de cálcio com lapso de tempo a filmes. Utilizou-Fluo-04:00 corante de carregamento astrócitos SVZ usando a aplicação de pressão no interior do tecido. Atividade de cálcio foi gravado utilizando um microscópio de varredura confocal permitindo uma resolução precisa para distinguir células individuais. A nossa abordagem é aplicável a outras zonas de origem neural, incluindo a zona do hipocampo adulto subgranular embrionárias e as zonas de origem neural. Além disso, outros tipos de corantes podeser aplicado utilizando o método descrito.

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Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Um método para carregar subventricular zona (SVZ) de células com corantes de cálcio indicador de actividade de cálcio gravação é descrito. A SVZ pós-natal contém células hermeticamente embalados, incluindo as células progenitoras neurais e neuroblastos. Ao invés de usar o carregamento banho foi injetado o corante por pressão dentro do tecido, permitindo uma melhor difusão de corante.

Preparação de fatias agudas zona subventricular for Imaging Cálcio

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

preparation-of-acute-subventricular-zone-slices-for-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K visualizações.  Yale University School of Medicine. Um método para carregar subventricular zona (SVZ) de células com corantes de cálcio indicador de actividade de cálcio gravação é descrito. A SVZ pós-natal contém células hermeticamente embalados, incluindo as células progenitoras neurais e neuroblastos. Ao invés de usar o carregamento banho foi injetado o corante por pressão dentro do tecido, permitindo uma melhor difusão de corante.

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The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

A zona subventricular En face: Coloração Wholemount e Fluxo ependimárias

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Neurociência

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Eletroporação Zona Neonatal subventricular

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Preparação de fatias aguda da medula espinhal para a gravação de células inteiras remendo-braçadeira nos neurônios da substância Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

Preparação de fatias hipocampais humanas agudas para gravações eletrofisiológicas

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nucleofecção eficiente de NSCs isoladas da zona subventricular murina

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Nucleofecção aprimorada para entrega de genes de alta eficiência em culturas de células-tronco neurais derivadas da zona subventricular murina</

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...