Embora inúmeros micróbios colonizem raízes vegetais, essas interações são difíceis de analisar à medida que acontecem no subsolo. Para facilitar isso, esta coleção de protocolos fornece uma visão geral das estratégias para vacinar raízes vegetais com micróbios transportados pelo solo. A inoculação radicular é a base para estudar interações de micróbios radiculares, e usando as seguintes técnicas, as interações podem ser estudadas em nível molecular, citológico ou histológico.
Explicamos três sistemas de inoculação usando verticillium como micróbio invasor de raízes, e a planta modelo, arabidopsis. No entanto, a transferência dos métodos para outras plantas, como o estupro de tomate ou obsmes, e para outros micróbios radiculares, por exemplo, serendipita benéfica, é possível. Prepare o verticillium inoculum com antecedência, culminando a micélia em PDB e induzindo esporulação e caldo de dextrose de Czapek.
Em seguida, comece despejando o meio autoclaved em placas de Petri. Após o endurecimento do meio, reembale as placas de Petri em um saco plástico estéril e armazene-as de cabeça para baixo durante a noite na geladeira a quatro a 10 graus Celsius. Corte e remova um canal de infecção no terço superior do meio solidificado com um bisturi.
Evite obter líquido ou ar sob o meio ágar durante o corte. Em seguida, use uma ponta de pipeta estéril para distribuir de 50 a 100 sementes de arabidopse esterilizadas na superfície superior cortada. Coloque as sementes no ângulo onde a superfície do ágar cortada entra em contato com a parede da placa de Petri para que as raízes possam crescer entre elas.
Feche as placas de Petri e seque-as com uma fita adesiva respirável para permitir a troca de gás. Mantenha as placas de Petri no escuro a quatro graus Celsius por dois dias para estratificação para garantir a germinação sincronizada e eficiente. Em seguida, coloque as placas verticalmente em um rack e plante as plantas em uma câmara de crescimento em condições de longos dias.
Após nove a 11 dias, quando as raízes atingem o canal de infecção, coloque as placas horizontalmente e abra-as. Em seguida, adicione 500 microliters de verticillium conidia recém-colhida diretamente no canal de infecção. Prepare as placas de controle adicionando 500 microliters de uma solução simulada em vez de esporos.
Incubar as placas de controle e esporos inoculadas horizontalmente até que o líquido esteja encharcado. Em seguida, feche a tampa e sele as placas com fita adesiva respirável. Cubra as partes da raiz com caixas de papel preto para escurecer raízes e fungos transportados pelo solo.
Incubar as placas verticalmente na câmara de crescimento. Realize as análises nos pontos de tempo preferidos após a inoculação. Primeiro, esterilize copos plásticos transparentes de 500 mililitros em banho de 70 a 75% de etanol por 20 minutos.
Seque as xícaras no capô de fluxo de lamina. Despeje o meio autoclaved nos copos de plástico. Prepare uma camada de plástico com cinco orifícios pré-fabricados um grande no centro e quatro menores em cada canto.
Coloque a camada de plástico sobre o meio antes de solidificar. Corte o ágar com um bisturi através do orifício central pré-fabricado a uma profundidade de cerca de 1,5 centímetros. Remova o ágar cortado para criar um canal de infecção para adicionar os esporos fúngicos mais tarde.
Coce ligeiramente o ágar médio com uma ponta de pipeta nos quatro orifícios menores para interromper a pele solidificada. Coloque as sementes usando uma ponta de pipeta nos orifícios menores. Feche o copo de plástico com um segundo copo de plástico invertido e vedação com fita adesiva respirável.
Mantenha as plantas a quatro graus Celsius por três dias no escuro para estratificação. Em seguida, incubar os sistemas de copos na câmara de crescimento. Para inocular plantlets com verticillium, adicione um mililitro de solução conídica no canal de infecção.
Para controles, adicione um mililitro de germe livre de um quarto de ms médio como uma solução simulada. Realize as análises nos pontos de tempo preferidos após a inoculação. Primeiro, misture completamente o solo e a areia em uma proporção volumosa de três para um que facilita a lavagem do substrato das raízes mais tarde.
Despeje a mistura em um saco de autoclave e vapor a 80 graus Celsius por 20 minutos em uma autoclave. Encha os potes com a mistura de areia do solo e transfira-os para bandejas. Adicione água nas bandejas cerca de um terço da altura de uma panela para imersão uniforme da mistura de areia do solo.
A água pulveriza a mistura para garantir condições de partida molhadas. Semear de três a quatro sementes em cada pote a distância suficiente uma da outra. Mantenha-os para estratificação a quatro graus Celsius por três dias no escuro.
Permita que as mudas cresçam em condições de longos dias com rega regular, em seguida, escolha plantas de tamanho e idade semelhantes para realizar a inoculação de mergulho raiz. Tire o solo das panelas e escava as raízes. Lave suavemente as raízes em um recipiente de água e mantenha as rosetas fora da água.
Incubar as raízes por 60 minutos em uma placa de Petri contendo a solução de esporos de verticillium ou solução simulada. Prepare novas panelas com vapor úmido solo esterilizado sem areia. Use uma ponta de pipeta para fazer um buraco no centro do solo em cada panela.
Coloque as raízes diretamente no orifício e rechee os orifícios suavemente com o solo para evitar estresse adicional às plantas. Cultive as plantas em condições de longo dia com rega regular. Realize as análises nos pontos de tempo preferidos após a inoculação.
No sistema à base de placas de Petri, a infecção bem sucedida de verticillium foi visualizada nas raízes da arabidopse. Dois dias após a inoculação, o gene marcador MYB51 foi fortemente induzido em raízes infectadas em comparação com o controle, o que foi confirmado pela análise QRTPCR. No sistema baseado em copos, uma alta quantidade de DNA fúngico foi encontrada nas folhas de plantas infectadas, como o gráfico mostra em comparação com o controle simulado após 12 dias de inoculação.
A análise de QRTPCR mostrou abundância de transcrição enriquecida do gene marcador MYB51 nas raízes arabidopsis. Usando este sistema, o verticillium foi inoculado para outras espécies de plantas modelo. No estupro da oleosa, o DNA fúngico foi detectável em segmentos de caule cortados na base das mudas 12 dias após a inoculação nas raízes.
O DNA fúngico também foi detectado em caules de tomate indicando propagação do patógeno dentro da planta. 21 dias após a inoculação usando o sistema à base do solo, as rosetas de plantas arabidopsis tratadas simuladas pareciam saudáveis e verdes, enquanto as plantas infectadas apresentavam folhas amareladas ou necrosadas e tinham menor área de folha verde em relação à simulação indicando infecção bem sucedida. Preste atenção ao cortar o canal de infecção no sistema de placa de Petri para evitar que o ágar deslize.
Aplicando o sistema à base de solo, não comprim o solo ao redor das raízes enquanto repoting para evitar mais estresse para as plantas. Após a inoculação radicular, por exemplo, testes patogênicos, análise da expressão genética, genômica funcional ou testes agroquímicos podem ser realizados fornecendo novas percepções sobre interações de micróbios radiculares e ferramentas para melhorar a agricultura.
