Esses métodos podem ajudar a investigar a progressão da inflamação crônica associada aos rins em pacientes com lúpus. Estamos oferecendo uma alternativa confiável e econômica que pode ser usada para monitorar o curso de doenças em lúpus. Comece a esterilizar o capô pulverizando 70% de etanol e coloque uma folha de plástico estéril na superfície.
Em seguida, prepare dicas, tubos de 1,5 mililitro e uma pipeta para coletar cerca de 20 microliters da urina. Pegue a gaiola e pulverize 70% de etanol antes de colocá-la dentro do capô. Depois, segure o mouse com uma mão e use a outra mão para massagear suavemente a área ventral de cima para baixo.
Usando um tubo de 1,5 mililitro ou pipeta, colete a urina diretamente. Ou se a amostra cair, colecione-a da folha de plástico. Então coloque o rato de volta na gaiola.
Corte os rins dissecados em tamanho de grão e digerir em cinco mililitros de tampão de digestão contendo Colagenase e DNase 1 em RPMI 1640 médio contendo HEPES por uma hora com agitação suave contínua a 37 graus Celsius. Adicione 10 mililitros de PBS gelado contendo 10 mililitros de EDTA e incubar por 10 minutos no gelo. Em seguida, vórtice a suspensão duas vezes.
Posteriormente, filtre a suspensão da célula através de um coador de 100 micrômetros e lave com 10 mililitros de HBSS cheios. Depois, centrífuga a 350 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente. Prepare uma solução percoll isotônica de 30, 37% e 70% de estoque e adicione uma camada de solução percoll de 37% em cima da solução de 70%.
Suspenda as células em cinco mililitros de 30% de estoque isotônico Percoll. Usando uma pipeta Pasteur carga lentamente 37% de cinco mililitros superiores e 70% de cinco mililitros na parte inferior, fazendo o gradiente percoll isotônico de estoque. Em seguida, centrífuga com o número nove e para baixo número zero a 1000 vezes G por 30 minutos em temperatura ambiente.
Depois, colete leucócitos da interface de 37 a 70% e suspenda-os em cinco mililitros de C 10. Novamente, centrífuga a 350 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Posteriormente, suspenda a pelota de célula em três mililitros de tampão de fax e centrífuga a 350 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, descarte o supernatante deixando cerca de 50 microliters do volume total. Adicione 50 microliters de bloco receptor FC por tubo. Seguindo esta mistura e incubar no gelo no escuro por 10 minutos.
Mais tarde, adicione dois mililitros de tampão de fax para lavagem. Em seguida, centrífuga a 350 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o supernacente deixando cerca de 50 microliters do volume total. Em seguida, adicione 20 microliters do corante fluorescente apropriado e deixe-o ficar por 15 a 30 minutos no gelo.
Adicione 50 microliters de mistura de anticorpos por tubo contendo CD 138 violeta brilhante sete 11 e CD 45 Alexa Fluor 700 e incubar no gelo no escuro por 15 a 30 minutos. Depois, adicione três mililitros de tampão de fax. Centrifugar a 350 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Remova o supernatante por vácuo deixando cerca de 50 microliters do volume total. Mais tarde, suspenda a pelota celular em 200 microliters da PBS. Para coletar a amostra incorpore o meio rim no pequeno criomold plástico com o composto de temperatura de corte ideal.
Em seguida, adicione gelo seco em uma caixa de espuma de poliestireno e coloque cuidadosamente o criomold em cima do gelo seco. Em seguida, remova a criomold, enrole-a em papel alumínio e armazene-a a menos 80 graus Celsius até usar mais. Em seguida, fixar o seco em quatro seções de micrômetros com acetona fria por 10 minutos.
Depois de fixar os slides, o ar seco por 0,5 a uma hora e armazená-los a menos 20 graus Celsius por um curto período de tempo ou menos 80 graus Celsius por um longo tempo. Para colorar as amostras, refixe os slides em acetona fria por cinco a 10 minutos e deixe que as seções aqueçam até a temperatura ambiente. Depois, usando uma caneta de tapinha, desenhe um círculo hidrofóbico ao redor da seção e deixe-o secar.
Em seguida, coloque slides em TBS no frasco de Copeland por 20 minutos e agite suavemente colocando o frasco no shaker. Posteriormente, despeje o TBS e encha o frasco com TBS 5%BSA e 0,1%TW 20. Mais tarde, incubar o frasco por 20 minutos sacudindo suavemente o shaker.
Em seguida, tire os slides e limpe a parte inferior dos slides. Adicione 100 microliters de anticorpos conjugados C3 encaixe C e IgG2 APE à seção e incubar a temperatura ambiente em uma câmara umidificada por uma hora. Lave a seção três vezes em PBS 5%BSA e 0,1%TW 20 por 10 minutos no agitador e depois agite os slides.
Monte a seção com um reagente anti-fade e, em seguida, com um deslizamento de cobertura. Em seguida, armazene os slides a quatro graus Celsius até visualizar sob o microscópio. Para análise de imagem usando o software imagem J, delineie a região desejada.
Depois, defina parâmetros padrão clicando em analisar e, em seguida, definir medidas e medir a área para obter os resultados. Em seguida, transfira os dados obtidos das janelas de medida para uma planilha. Uma vez feito, clique em analisar para medir a região e transferir os dados novamente para a planilha anterior.
Os níveis de proteína na urina dos camundongos MRL LPR foram detectados ao longo do tempo em que foram tratados com soro fisiológico tamponado fosfato como o grupo controle e lactobacillus reuteri como o grupo de tratamento. O grupo de camundongos tratado com L.reuteri em uma progressão de proteinúria mais agressiva do que o grupo controle. A análise de fax foi realizada para os leucócitos renais isolados analisarem as células plasmáticas.
Além disso, os camundongos foram tratados com vancomicina ou vancomicina, juntamente com DNA duplo encalhado de Escherichia coli. Embora espera-se que o DNA duplo encalhado de Escherichia coli desencadeie a infiltração renal, nenhuma diferença significativa foi encontrada na porcentagem de células plasmáticas. O complemento C3 e IgG2a foram detectados através de coloração de imunofluorescência em seções renais mrl ipr femininas.
Os fatores ambientais eficazes na deposição renal de C3 e IgG2a foram comparados para o pão de camundongos interno na instalação animal e aqueles comprados de um vendedor. A análise imunohistoquímica não mostrou diferença entre os dois grupos. Adicionar cada camada da solução de estoque percentual ISO 20 Percoll pode ser desafiador, e se eles se misturarem, você tem que começar de novo.
Este procedimento ajuda com o citómetro de fluxo e em experimentos vitter, de modo que você não pode estudar o tipo diferente de células renais de populações. Este procedimento nos permite estudar as células B infiltradas nos rins e não há muita informação na literatura.
