Este método tenta descrever três métodos frequentemente utilizados para avaliar a migração de neutrófilos normais in vivo e in vitro, bem como a infiltração de neutrófilos patológicos no modelo de artrite do camundongo. Achamos que esse método pode ser útil para outros pesquisadores neste campo. Este protocolo contém os detalhes metodológicos para avaliar a capacidade de migração de neutrófilos nos locais de inflamação usando ensaio de bolsa de ar e artrite induzida por adjuvante.
As implicações dessa técnica se estendem para a terapia da artrite, comparando o grupo modelo com o grupo de tratamento. Este método poderia fornecer insights sobre doenças inflamatórias e pode ser aplicado a doença inflamatória intestinal. Demonstrando o procedimento estarão Qingyi Lu e Haixu Jiang, estudantes de pós-graduação do nosso laboratório.
Após a anestesia dos camundongos no dia zero, use um filtro de 0,22 mícrons ligado a uma seringa de cinco mililitros para obter um volume de três mililitros de ar esterilizado. Levante a pele traseira do rato anestesiado com pinças e use subcutâneamente um medidor de 26 por agulha de 3/8 polegadas para injetar três mililitros do ar esterilizado. Após o tratamento, remova os camundongos da unidade de respiração e coloque-os em uma gaiola bem definida.
Monitore os ratos para garantir que eles estejam vivos até que comecem a se mover. No terceiro dia, injete mais três mililitros de ar esterilizado no bolso de ar previamente estabelecido para sustentar a bolsa de ar. No sexto dia, injete diferentes tratamentos na bolsa de ar.
Injete um mililitro de PBS como controle negativo e injete um mililitro de um micrograma por mililitro LPS como o controle positivo para induzir inflamação local. Depois de seis horas, sacrifique os ratos. Para cada bolsa de ar, injete um mililitro de tampão de lavagem para lavar a bolsa de ar e coletar o exsudato inflamatório em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Em seguida, lave a bolsa de ar com dois mililitros de tampão de lavagem duas vezes e colete o exsudato inflamatório no mesmo tubo de centrífuga. Centrifugar a 100 vezes g por 10 minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernatante e resuspenque as células em um mililitro de tampão de lavagem.
Conte as células para quantificar a razão de neutrófilo usando o analisador automático de hematologia. Suspender o adjuvante completo de Freund vórtice pelo menos cinco segundos, em seguida, desenhar 100 microliters de suspensão em um injetor de insulina. Após anestesiar, marque a pata escolhida e injete 20 microliters de adjuvante completo de Freund do injetor em quatro pontos periarticulares no espaço articular do tornozelo.
Coloque os ratos processados na nova câmara. Monitore os ratos para garantir que eles estejam respirando até que recuperem a capacidade de se mover. A cada três dias, use um medidor de espessura de bolso para medir o diâmetro da articulação do tornozelo.
Além disso, avalie a gravidade da artrite pelo critério de pontuação da artrite. Zero é normal. Não há evidência de eritema e inchaço.
Uma é a artrite mais leve. Eritema e inchaço leve confinados às manchas ou articulação do tornozelo. Dois é a artrite moderada.
Eritema e inchaço leve estendendo-se do tornozelo até as manchas. Três é a artrite grave. Eritema e inchaço moderado estendendo-se do tornozelo para as articulações metatarsas.
Quatro é a artrite mais grave. Eritema e inchaço severo abrangem o tornozelo, o pé e os dígitos, ou anquilose do membro. Depois de sacrificar o rato, remova a pele e parte do músculo da perna traseira com pinça e tesoura.
Pulverize a articulação com 70% de etanol e remova o resto dos músculos usando uma toalha de papel. Fixar a articulação do tornozelo em 4% de paraformaldeído por dois dias em temperatura ambiente. Em seguida, decalcifice a articulação em 10% EDTA por um mês em temperatura ambiente e mude o médio semanalmente.
Após um mês, coloque o tecido em um molde marcado com certo volume de parafina líquida a aproximadamente 60 graus Celsius para incorporar o tecido. Esfrie brevemente. Coloque a espessura do microtoma em quatro micrômetros e corte as fatias.
Em seguida, flutue as seções em um banho de água de 43 graus Celsius por um curto período de tempo para expandir as seções. Monte as seções em slides e coloque os slides no forno a 70 graus Celsius por duas horas. Para uso futuro, conservar os slides a menos 20 graus Celsius.
Em seguida, coloque os slides em um rack e realize lavagens em xileno e etanol de acordo com o manuscrito para reidratar à temperatura ambiente. Por fim, lave na água da torneira por três minutos. Em seguida, colora a solução verde 0,1% rápida por cinco minutos.
Enxágüe em ácido acético de 1% por 10 segundos e colora em solução de coloração 0,1%Safranin O por 20 minutos. Depois disso, mergulhe os slides nas soluções de lavagem de xileno e etanol de acordo com o manuscrito. Monte as seções teciduais no estágio do objeto e observe os tecidos sob um microscópio.
Para visualizar os neutrófilos, realize a coloração imunohistoquímica primeiro assando as seções de parafina por duas horas a 78 graus Celsius. Coloque os slides em um rack e realize as lavagens de xileno, etanol, água e PBS de acordo com o manuscrito para reidratar à temperatura ambiente. Em seguida, adicione uma gota de tampão de permeabilização para cobrir o tecido.
Incubar as seções em uma bandeja controlada pela umidade a 37 graus Celsius por 10 minutos. Depois disso, enxágue os slides em PBS por três minutos três vezes. Evite enxaguar o tecido diretamente.
Em seguida, realize a recuperação de epítope de antígeno induzido pelo calor. Organize os slides em um rack. Mergulhe os slides na caldeira de pressão cheia de tampão de recuperação.
Coloque a caldeira de pressão no forno micro-ondas e coloque o forno micro-ondas em 600 watts e aqueça os slides por 10 minutos. Depois de ferver, mantenha os slides na caldeira para esfriar a 90 graus Celsius. Tire os slides e enxágue-os em PBS por três minutos três vezes.
Para saciar a atividade peroxidase endógena, mergulhe os slides em peróxido de hidrogênio recém-preparado em 3% à temperatura ambiente por 15 minutos. Enxágüe slides em PBS por três minutos três vezes. Delineie um grande círculo ao redor da amostra com uma caneta hidrofóbica.
Evite tocar na amostra. Adicione à amostra 50 a 100 microliters de 3% de albumina de soro bovino para bloquear e colocar as amostras em uma câmara controlada pela umidade a 37 graus Celsius por 60 minutos. Em seguida, remova a solução de bloqueio.
Adicione 50 microliters de anticorpo primário diluído pbs a cada seção rapidamente. Incubar os slides em uma bandeja controlada pela umidade a quatro graus Celsius durante a noite. No segundo dia, tire a bandeja e deixe-a em temperatura ambiente por 30 minutos.
Em seguida, enxágue os slides em PBS por três minutos três vezes. Adicione 50 microliters de anticorpos secundários diluídos de PBS aos tecidos. Incubar lâminas em uma bandeja controlada pela umidade a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, enxágue os slides em PBS por três minutos três vezes. Desenvolver em solução DAB diluída por cinco minutos. Evite o desenvolvimento de uma cor escura causada pela reação exagerada do DAB.
Enxágüe os slides em água destilada. Contratente os slides na hematoxilina por 10 segundos e enxágue os slides na água da torneira por cinco minutos. Enxágüe na solução de diferenciação super rápida do álcool ácido por três segundos e enxágue na água da torneira por 10 minutos.
Mergulhe os slides nas lavagens de etanol e xileno à temperatura ambiente de acordo com o manuscrito. Corrija o deslizamento de tampas com a solução de montagem. Observe o tecido sob um microscópio.
Neste estudo, foram realizados experimentos com bolsas de ar para investigar o recrutamento de neutrófilos estimulado pelo LPS in vivo. Os subconjuntos de leucócitos nos exsudatos de bolsa de ar eram muito mais altos do que no controle. Em comparação com o grupo controle, o grupo de artrite induzido por adjuvante apresentou edema significativo na pata.
O diâmetro da articulação do tornozelo aumentou e o escore da artrite aumentou consistentemente. Dano na cartilagem é a síndrome representativa da artrite reumatoide. O desafio da CFA induziu uma grande quantidade de infiltração de leucócitos, erosão significativa da cartilagem e hiperplasia sinovial.
MpO em qualquer níveis de expressão são marcadores representativos de infiltração de neutrófilos que foram significativamente regulados na seção conjunta. Certifique-se de que o ar é injetado na pele, mas não no músculo. Também podemos investigar a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos por coloração imunohistoquímica das seções de tecido articular do tornozelo com anti-p84 ou Esses métodos podem ser usados para estudar outras doenças inflamatórias, como doença inflamatória intestinal.
