Este protocolo é significativo devido à simplicidade da plataforma de sensores TGT usada para estudar o crosstalk EGFR-integrin e sua influência sobre as forças mecânicas celulares. Rao esboçou para investigar a regulação dependente do EGF da mecânica celular. O protocolo é adaptável para diferentes ligantes, tipos de células, paradigmas de estimulação, e pode ser acoplado com TGTs de diferentes limiares de tensão.
A síntese superficial pode parecer intimidante no início. A chave é estar preparado e organizado para executar com precisão as etapas intrincadas, empregando uma lista de verificação para preparação e cálculos de reagentes. No primeiro dia, coloque até oito tampas de vidro de 25 milímetros em um rack de politefluoroetileno.
Coloque o rack em um béquer borossilicato de 50 mililitros contendo 40 mililitros de etanol à prova de 200. Sonicate a uma frequência de operação de 35 kilohertz por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. Encha um béquer de 50 mililitros com 40 mililitros de solução de piranha recém-preparada misturando ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio em uma proporção de 3:1 em um béquer Pyrex e mexendo com uma pipeta de vidro.
Transfira o rack de deslizamento de tampa para o béquer e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente no capô da fumaça para gravar a superfície de deslizamento de tampa. Após a gravação, transfira o rack de deslizamento de tampa para um béquer com água ultrapurada com pinças. Inspecione visualmente os deslizamentos de cobertura para garantir que as superfícies pareçam limpas sem padrões ou partículas de poeira na superfície do vidro.
Transfira o rack de deslizamento de tampa para um béquer com etanol à prova de 200 e lave duas vezes por 15 segundos para equilibrar superfícies para solvente orgânico. Transfira o rack de deslizamento de cobertura para uma solução de etanol à prova de 200 com 3% de APTES por uma hora à temperatura ambiente para silanizar os deslizamentos de cobertura. Mergulhe o rack em um béquer limpo com solução de etanol à prova de 200.
Seque os deslizamentos de cobertura usando gás nitrogênio com baixa pressão de saída. Coloque a tampa deslizada em um prato de poliestireno de 10 centímetros com um pedaço de filme parrafina colocado no fundo. Adicione 100 microliters de dois miligramas por solução de biotina NHS mililitro em DMSO a quatro deslizamentos de cobertura colocados em filme de parafina.
Coloque um sanduíche com os outros quatro deslizamentos de cobertura em cima, com dois deslizes de cobertura voltados para o outro com a solução de funcionalização no meio. No segundo dia, retire o prato de quatro graus Celsius e separe os deslizamentos de cobertura sanduíche. Evite arranhar ou danificar a superfície funcionalizada enquanto separa o sanduíche.
Em seguida, oriente os deslizamentos de tampa no rack com a superfície revestida voltada uma para a outra. Seque com gás nitrogênio. Coloque os deslizes de capa em um novo prato com um filme parrafin dentro dele.
Adicione 800 microliters de 0,1% de gróbio bovino em 1X PBS a cada deslizamento de capa. Incubar os deslizamentos de cobertura à temperatura ambiente por 30 minutos para passar a superfície e bloquear a ligação inespecífica dos reagentes de funcionalização subsequentes. Para funcionalizar os deslizamentos de cobertura, adicione 800 microliters de um micrograma por mililitro de streptavidina em 1X PBS em temperatura ambiente por 45 a 60 minutos.
Monte as sondas TGT em um tubo PCR usando um termociclador. Após a incubação, lave os deslizamentos de tampa três vezes com 1X PBS. Adicione 100 microliters das sondas TGT pré-remontadas a quatro deslizamentos de cobertura e faça sanduíches usando os quatro deslizamentos de cobertura restantes com o lado funcionalizado voltado para as sondas.
Cubra com papel alumínio. Após a incubação, separe os sanduíches e lave os deslizamentos de cobertura com 1X PBS três vezes. Monte cuidadosamente os deslizamentos de cobertura em câmaras de imagem pré-limpas.
Para investigar o efeito da estimulação do fator de crescimento epidérmico na mecânica Cos-7, adesão e disseminação celular, trippsinize células Cos-7 com 0,05% de trippsin-EDTA por dois minutos. Neutralizar a trippsina lavando com HBSS e centrifugando a 800 G por cinco minutos. Células de placa a uma densidade de 40.000 células nas superfícies TGT montadas em DMEM complementadas com 50 nanogramas por mililitro EGF ou DMEM sem EGF.
Após a incubação, lave as células três vezes com 1X PBS. Conserte com dois mililitros de 4% de paraformaldeído por 12 minutos em temperatura ambiente. Lave os deslizamentos de tampa cinco vezes com 1X PBS em intervalos de cinco minutos à temperatura ambiente.
Opcionalmente, incubar os deslizamentos de cobertura com cloreto de amônio de 50 milimil em 1X PBS por 30 minutos a 37 graus Celsius. Adicione o tampão A e coloque as câmaras de imagem com deslizamentos de cobertura em um recipiente de umidade. Incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius para bloquear e permeabiliizar as células.
Diluir o anticorpo anti-paxillina primário em 1:250 diluições no buffer de bloqueio. Incubar com 200 microliters de solução de anticorpos primários por deslizamento de cobertura por duas horas a 37 graus Celsius. Células de rotulagem simultaneamente com uma mistura de anticorpo secundário de cabra/anti-coelho di-conjugado a 1:800 diluição e faloideína di-conjugada em 1:400 diluições em 200 microliters de tampão de bloqueio por deslizamento de cobertura.
Lave as superfícies cinco vezes com 1X PBS em intervalos de cinco minutos. Para começar, adicione óleo ao objetivo, limpe o fundo de deslizamento da tampa da câmara de amostra e coloque a amostra no palco. Concentre-se em uma célula e engaje o foco perfeito.
Alinhe o RICM fechando e centralizando o diafragma de abertura epi-iluminação. Concentre o laser de 488 nanômetros em um pequeno ponto no teto da sala e aumente o ângulo de incidência até além do ângulo crítico, enquanto monitora a fluorescência na câmera em um modo ao vivo. Observe uma redução acentuada da fluorescência de fundo e um único plano em foco quando o ângulo crítico for superado.
Identifique células para imagens usando o modo ao vivo da câmera usando RICM. Adquira as imagens RICM e TIRF de actin a 488-nanômetro excitação, tensão integrin em 561 nanômetros excitação, e paxillin em 647 nanômetros excitação. Obtenha imagens sequencialmente usando um tempo de exposição de 200 milissegundos.
Mude os deslizes da tampa, concentre-se e repita. As células Cos-7 foram banhadas nesta superfície TGT com ou sem estimulação EGF para estudar o impacto da ativação do EGFR com estimulação de ligantes na mecânica da integrin. Se um integrin ligar o ligante e aplicar uma força maior que o limiar de tensão total da sonda, o duplex de DNA se separará, levando à fluorescência.
Qualquer sonda TGT que uma força mecânica não tenha rompido permanecerá não fluorescente. As células foram incubadas com ou sem EGF nas superfícies TGT por 60 minutos, fixas e imunos detidas para exibir a distribuição de adesão focal e a organização do citoesqueleto. Na imagem RICM, a célula Cos-7 que se espalhava na superfície TGT de 56 piconewton foi significativamente melhorada com a estimulação EGF em comparação com sem estimulação.
A estimulação com eGF resultou em uma morfologia mais circular, representando a expansão e o crescimento das células Cos-7. A fluorescência de sondas abertas também é maior com a estimulação EGF, como observado na imagem de fluorescência de tensão. A intensidade integrada de sondas abertas proporcional ao número de sondas abertas foi muito maior com estimulação EGF do que sem estimulação.
Lembre-se sempre da orientação dos deslizamentos de cobertura, mantendo a superfície funcionalizada voltada para cima. Ao separar o sanduíche, seja gentil para que a superfície não seja arranhada ou danificada. Seguindo a síntese superficial, pode-se sondar proteínas citoplasmáticas que regulam a adesão celular ou transdução mecânica.
Isso permite a identificação de moléculas de sinalização a jusante envolvidas na orquestração da mecânica celular na membrana plasmática.
