CUT&RUN é uma técnica poderosa para determinar a localização de proteínas na cromatina, e aqui descrevemos uma versão unicelular desta técnica em um formato manual de 96 poços. A maioria das técnicas de localização de proteínas, como o ChIP-seq, requerem alta entrada celular e levam aproximadamente três dias para serem concluídas. A CUT&RUN, devido ao alto sinal e baixo fundo, foi otimizada para aplicação de células baixas e unicelulares, e pode ser concluída em um único dia.
Prevemos que essa técnica pode ser aplicada a quase qualquer amostra biológica e pode ser especialmente poderosa para determinar a localização de fatores em amostras raras e de baixa abundância, como amostras preciosas de pacientes. Antes de realizar qualquer experimento unicelular, teste o anticorpo e a técnica em um alto número de células não preciosas. A principal limitação deste experimento é a dependência de um anticorpo robusto.
Demonstrando o procedimento está Santana Lardo, especialista em pesquisa experiente do meu laboratório. Depois de classificar células únicas e núcleos de ligação para contas, coloque a placa de 96 poços em um rack magnético de 96 poços e permita que as contas se liguem por um mínimo de cinco minutos. Em seguida, remova e descarte o supernatante.
Adicione 100 microliters de tampão de bloqueio às contas ligadas ao núcleo, misture com tubos suaves e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços e deixe o supernatante limpar por um mínimo de cinco minutos. Em seguida, remova e descarte o sobrenante sem perturbar as contas.
Remova a placa do rack magnético e resuspenja as contas em 100 microliters de tampão de lavagem por reação com tubulação suave. Coloque a placa de volta no rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar e, em seguida, remova e descarte o supernatante. Resuspenja as contas em 25 microliters de tampão de lavagem por reação com tubulação suave.
Faça uma mistura principal de mestre de anticorpos aliquoting 25 microliters de tampão de lavagem por reação e, em seguida, adicione 0,5 microliters de anticorpos por reação. Adicione 25,5 microliters da mistura de tampão de lavagem de anticorpos, seguido de tubulação suave a cada amostra que está sendo tratada com um anticorpo visando a proteína de interesse. Incubar por uma hora em temperatura ambiente.
Em seguida, novamente coloque as amostras de volta no rack magnético de 96 poços. Uma vez que o supernante esteja claro, remova e descarte-o sem perturbar as contas. Depois de remover a placa do rack magnético, lave as contas com 100 microliters de tampão de lavagem e resuspend por pipetação.
Depois de colocar a placa de volta em um rack magnético de 96 poços e descartar supernadante como demonstrado anteriormente, resuspenque cada amostra em 25 microliters de tampão de lavagem. Faça uma mistura mestre de proteína A MNase adicionando 25 microliters de tampão de lavagem e uma quantidade otimizada de proteína A MNase por reação. Adicione 25 microliters de proteína A MNase mistura mestre a cada amostra, incluindo as amostras de controle.
Incubar as amostras por 30 minutos em temperatura ambiente. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços. Deixe o supernatante limpar por um mínimo de cinco minutos e, em seguida, remover e descartar o supernatante sem perturbar as contas.
Depois de remover a placa do rack magnético, lave as contas com 100 microliters de tampão de lavagem e resuspend por tubulação suave. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços e descarte o supernatante como demonstrado anteriormente. Em seguida, remova as amostras do rack magnético e resuspenja as contas em 50 microliters de tampão de lavagem por tubulação suave.
Equilibre as amostras a zero graus Celsius em uma mistura de água gelada por cinco minutos e, em seguida, remova as amostras do banho de água gelada. Adicione um microliter de 100 mililitros de cálcio usando uma pipeta multicanal. Misture bem três a cinco vezes com pipetagem suave usando uma pipeta multicanal de grande volume e, em seguida, devolva as amostras a zero graus Celsius.
Inicie um temporizador de 10 minutos assim que a placa voltar ao banho de água gelada. Pare a reação pipetando 50 microliters de uma solução contendo o dobro da concentração de RSTOP+e tampão em cada poço na mesma ordem que o cloreto de cálcio foi adicionado. Incubar as amostras por 20 minutos a 37 graus Celsius.
Gire a placa a 16.000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços. Deixe o supernatante limpar por um mínimo de cinco minutos.
Em seguida, transfira supernantes para uma placa fresca de 96 poços e descarte as contas. Para extração de DNA, adicione um microliter de 10% SDS e 0,83 microlitres de 20 miligramas por mililitro proteinase K a cada amostra e misture as amostras por pipetação suave. Incubar as amostras por 10 minutos a 70 graus Celsius.
Volte a placa à temperatura ambiente. Adicione 46,6 microliters de cloreto de sódio de cinco molares e 90 microlitres de 50%PEG4000 e misture por tubulação suave. Adicione 33 microliters de contas de magnetita de poliestireno a cada amostra e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente.
Coloque a placa em um rack magnético e deixe o supernatante limpar por cerca de cinco minutos. Então, descarte cuidadosamente o supernatante sem perturbar as contas. Enxágüe duas vezes com 150 microliters de 80% de etanol sem perturbar as contas.
Gire a placa brevemente a 1000 vezes G por 30 segundos. Coloque a placa de volta em um rack magnético de 96 poços e remova todo o etanol residual sem perturbar as contas. A seco as amostras por cerca de dois a cinco minutos.
Resuspenque as contas em 37,5 microlitres de 10 mililitros TRIS de pH 8 e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Coloque a placa de volta em um rack magnético e deixe as contas se amarrarem por cinco minutos. Transfira 36,5 microliters do supernante para uma placa de 96 poços compatível com termociclismo fresco e descarte as contas.
Após a realização da avaliação da qualidade celular, a aparência celular e a porcentagem foram examinadas, demonstrando que células-tronco embrionárias de baixa qualidade não devem ser utilizadas. A classificação unicelular foi realizada usando a mancha hoechst 33342, e as células de teste foram contadas para garantir que zero ou uma célula seja encontrada em cada poço. A análise do gel de Agarose revelou uma escada de baixo peso molecular e bibliotecas individuais de uliCUT&RUN de células únicas.
Análises de bibliotecas subótias e ideais mostram uma escada de baixo peso molecular, biblioteca subótima devido à digestão de Mnase ineficiente e biblioteca bem sucedida com digestão adequada. A distribuição do analisador de fragmentos mostra que o tamanho esperado de células únicas varia de 150 a 500 pares de base. No entanto, em grandes proteínas, o DNA terá cerca de 270 pares de bases.
A ocupação proteica usando o navegador de genoma de locus único representando o alto número de células ou controle negativo e o CTCF uliCUT&RUN de célula única revelou que uma única célula representava picos fortes, semelhantes aos uliCUT&RUN de células altas. Mapas de calor de CTCF de célula única ou controle negativo revelaram um padrão claro de enriquecimento de leitura diretamente sobre locais de ligação CTCF estabelecidos nas células. Mapas de calor unidimensionais mostram uma maior densidade de leitura sobre locais de ligação CTCF estabelecidos em bibliotecas unicelulares em relação às regiões circundantes e controles sem anticorpos, demonstrando enriquecimento específico de anticorpos em locais de ligação estabelecidos.
Equilibrar os núcleos ligados a contas no banho de água gelada e não superaquecer a amostra após a adição de cloreto de cálcio é importante para evitar a digestão excessiva da cromatina.
