Agradecemos a Yutian Gan para o uso da Figura 3. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation 0420971; do Smith College Blakeslee, Wilens e fundos de Holmes, e da Howard Hughes Medical Institute.

1. Preparação de amostras <ol><li> Use tecido fresco, congelado ou flash-RNAlater tratados de camundongos como matéria-prima. Blot fora qualquer excesso com um conservante Kimwipe antes de prosseguir. </li><li> Remova todos os tendões e fáscia muscular e em todo o mince o tecido com um único lâminas de barbear afiada por 2 min em placas de vidro refrigerada em uma câmara fria (4 ° C) até que o tecido é bem picada ou em pó. Recolher a amostra para um tubo de microcentrífuga pré-pesados ​​e determinar o peso do tecido. Não use mais de 10 mg do tecido como o seu material de partida. </li><li> Adicionar 45 mL tampão de extração (8 M uréia, 50 mM DTT, CHAPS 4%, 0,2% ampholytes transportadora 08/05, 0,0002% de azul de bromofenol) por um tecido mg picada, à temperatura ambiente. Se o volume for superior a 350 mL, adicione 350 mL inicialmente e homogeneizar (passo 1.4), em seguida, adicione o restante do buffer para minimizar respingos. </li><li> Homogeneizar o tecido sete vezes com um pilão motorizado (Kontes Corp) por 15 segundos a4 ° C, com dois minutos de resfriamento sobre o gelo entre cada homogeneização. </li><li> Centrifugar as amostras a 15.600 xg por 30 minutos a 4 ° C. Salve o sobrenadante e medir o seu volume. A célula de detritos pellet é descartado. </li><li> Precipitar as proteínas no sobrenadante com acetona gelada grau reagente (3 vezes v: relação v). Vortex por 15 segundos. Centrífuga para 15.600 xg por 10 segundos para formar pelotas, e ressuspender em tampão de extração com o motor Kontes e hastes de polipropileno mexendo (BioSpec Prod) </li><li> Repita o passo 1,6. </li><li> Quer continuar com a estimativa de concentração de proteínas das amostras ou armazená-los a -20 ° C. </li></ol> 2. Estimativa de concentração de proteína Use o ensaio Lowry 7 ou 8 do ensaio BCA (Pierce); apontar para cerca de 4,5 mg ml -1. 3. Focalização isoelétrica <ol><li> Retire uma tira IPG ReadyStrip (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad)de -20 ° C e deixe-se equilibrem em temperatura ambiente por 10-15 min. </li><li> Vortex da amostra e pipeta 600-800 g (volume total 200 mL) de amostra de proteína em uma linha reta na extremidade traseira de um canal na bandeja de reidratação de amostra, deixando cerca de 1 cm em cada extremidade. </li><li> Usando pinça, retire a tampa de plástico da tira IPG - certifique-se de lidar com apenas as extremidades da tira e evitar qualquer contato com o gel. Nota final básicos da tira e posicione-o no lado esquerdo da bandeja. Coloque a tira de IPG gel lado-down no topo da amostra, evitar bolhas prendendo embaixo. Permita que ele se hidratar durante uma hora. </li><li> Sobreposição com 2,5 mL de óleo mineral (BioRad). Cubra o tabuleiro com a tampa, e deixe hidratar durante a noite a temperatura ambiente. </li><li> Coloque um pavio de papel em ambas as extremidades do canal bandeja de foco e molhados cada um com 10 mL de água Millipore. </li><li> Retire IPG strip e mantenha verticalmente por cerca de 10 segundos a drenar o óleo. Blot a b plásticoacking com um Kimwipe. </li><li> Coloque o lado gel IPG strip para baixo e com final básicos para a esquerda na bandeja de foco. Cobrir a faixa com 2,5 mL de óleo mineral. </li><li> Coloque a bandeja para dentro da célula IEF PROTEAN (Bio-Rad) e um programa de um protocolo de 3 etapas (Tabela 1) à temperatura de célula padrão de 20 ° C, uma corrente máxima de 50 mA / strip, e não há tempo de reidratação. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Tensão </td><td> Tempo </td><td> Volt-Hrs </td><td> Rampa </td></tr><tr><td> Passo 1 </td><td> 250 </td><td> 20 min </td><td></td><td> Linear </td></tr><tr><td> Passo 2 </td><td> 8000 </td><td> 2,5 hr </td><td></td><td> Linear </td></tr><tr><td> Passo 3 </td><td> 8000 </td><td></td><td> 40000 </td><td> Rápido </td></tr><tr><td> Total </td><td></td><td> 6,5 hr </td><td> 40000 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Três etapas protocolo de PROTEAN célula IEF de 11 centímetros IPG tiras. </li><li> Pegue as tiras IPG para fora da célula IEF usando uma pinça. Blot o apoio de plástico com uma Kimwipe e coloque o lado gel IPG strip-se em uma bandeja de reidratação limpo. Você pode cobrir a bandeja de reidratação e envolvê-la com filme plástico e guarde a - 80 ° C ou prosseguir. </li></ol> 4. SDS eletroforese em gel de poliacrilamida <ol><li> Transferência da faixa (até lado gel) em uma bandeja de equilíbrio 11 cm. </li><li> Adicionar 4 mL de tampão de redução (6 M uréia, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, glicerol 20%, DTT 2%) para o canal e equilibrar a tira durante 10 min com agitação suave. </li><li> Remova o tampão de redução, adicionar 4 mL de tampão de alquilação (6 M uréia, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, glicerol 20%, 2,5% iodoacetamida) e equilibrar a tira durante 10 minutos com agitação suave. </li><li> Lave a tira IPG por imersão a strip brevemente em um tampão SDS X rodando (25 mM Tris, 192 mM de glicina, 0,1% SDS, pH 8.2). </li><li> Lay o lado gel strip para cima da placa traseira do Critério de 11 cm pré-moldados de 10,5% -14% Tris-HCl em gel de poliacrilamida SDS (Bio-Rad) e empurre-o suavemente de modo que ele faz pleno contato com o gel SDS; certifique-se não haja bolhas entre as duas superfícies gel. </li><li> Sobreposição da tira IPG com 1 mL de solução de agarose derretida (0,5% agarose, 25 mM Tris, 192 mM de glicina, 0,1% SDS, de azul de bromofenol) e deixe o agarose solidificar por 5 minutos. </li><li> Carga de 5 mL de proteína marcadora 10-225 kDa (USB, P / N: 76740) no único poço como padrões de peso molecular. </li><li> Execute o gel em tampão SDS (25 mM Tris, 192 mM de glicina, 0,1% SDS, pH 8,2) em 200 V à temperatura ambiente ou em uma câmara fria (4 ° C) usando a migração frente corante azul de bromofenol para monitorar a eletroforese. </li><li> Remova o gel do elenco de plástico e mancha durante a noite, agitando suavemente em Coomassie Brilliant BlueR-250 mancha (45,5% de metanol, 45,5% dH2O, 9,0% de ácido acético, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250). </li><li> Agitar o gel em uma solução Destain (45,5% de metanol, 45,5% dH 2 O, 9,0% de ácido acético) duas vezes por 3 horas cada um e em Destain 2 (metanol 5%, 90% dH 2 O, 5% de ácido acético) durante a noite. Armazenar o gel em 7% de ácido acético para análise. </li></ol> 5. Gel de imagem e análise <ol><li> Capturar imagens dos géis usando o programa de software One Quantidade que opera o sistema de imagem VersaDoc (BioRad). Cortar as áreas da imagem de modo uniforme para todos os géis em sua experiência. </li><li> Carregar as imagens recortadas no programa PDQuest software 8.0 para criar um conjunto de experimento. Siga o assistente de configuração da experiência para definir os parâmetros para detecção de ponto e ponto de correspondência através do gel. Inspecionar e refinar o local correspondência resultados manualmente, se necessário. </li><li> Realizar uma análise quantitativa e estatística dos géis para detectar manchas de proteínas combinado com two-fold ou superior diferenças estatisticamente significativas na expressão entre os dois grupos gel. Crie uma análise conjunto com estes pontos de interesse e cortá-los, utilizando um cortador local EXQuest (BioRad) para tripsina digestão e LC-MS identificação baseada em proteína. </li></ol> 6. Em gel-digestão tríptica Para esta etapa um Pierce modificado In-Gel Digest tríptico Kit (# 89871X, Pierce) protocolo é usado. <ol><li> Adicionar 200 mL de solução de descoloração (25 mM de bicarbonato de amônio, acetonitrila 50%) para as velas em gel. Vortex e incubar as amostras a 37 ° C por 30 minutos com agitação. Remova e elimine cuidadosamente a solução. </li><li> Repita o passo 6.1. </li><li> Adicionar 30 mL de recém-preparados buffer (50 mM Tris [2-carboxietil] fosfina, 22,5 mM de bicarbonato de amônio) para os tubos contendo as velas em gel e incubar a 60 ° C por 10 minutos. Reduzindo </li><li> Permitem que as amostras para esfriar e, depois, remover e descartar o buffer de redução.</li><li> Adicionar 30 mL de tampão de alquilação (100 iodoacetamida mM, 20 mM de bicarbonato de amônio, preparado imediatamente antes da utilização em papel alumínio envolto em tubos. Incubar as amostras no escuro à temperatura ambiente por 1 hora. </li><li> Remova e descarte o buffer de alquilação. Lave as velas gel pela adição de 200 mL de solução de descoloração a cada tubo. Incubar as amostras a 37 ° C por 15 minutos. </li><li> Remova e descarte a solução de descoloração e repita a lavagem. </li><li> Adicionar 50 mL de acetonitrila para as velas em gel e incube-os por 10 minutos à temperatura ambiente, que lhes permitam reduzir seca, em seguida, remova cuidadosamente a acetonitrila. </li><li> Repita 6,8 passo mais uma vez. Pedaços de gel devem ser brancos e pequenos. </li><li> Permitem que pedaços de gel para secar em um concentrador de CentriVap (Labconco, modelo EX1245) por 10 minutos. </li><li> Engrossar as peças gel, adicionando 10 mL de solução de tripsina ativado (10 tripsina ng / mL, bicarbonato de amônio 25 mM). Incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. </li><li> Adicionar 25 mL tampão de digestão (25 mM de bicarbonato de amônio) para os tubos. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante a noite com agitação. </li><li> Sonicate as amostras por 10 minutos (Branson, modelo banho sonicador 2510) e spin-las antes de remover o sobrenadante para um novo tubo. Salve o sobrenadante. </li><li> Para continuar a extrair os peptídeos, adicionar 10 mL de 0,1% de ácido fórmico e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente com agitação. Sonicate as amostras por 10 minutos, recolher o sobrenadante e combinam com sobrenadante salvou na etapa 6.13. </li></ol> 7. Dessalinização microescala de extratos de peptídeo <ol><li> Remover bicarbonato de amônio e outros sais nos extratos peptídeo com a ajuda de PepClean C-18 Colunas Spin (ThermoFisher) de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Peptídeos eluir duas vezes com 20 mL de acetonitrila 70%, evaporar as amostras secas por centrifugação no Concentrador CentriVap por 1 hora e ressuspenderos peptídeos em 10 mL de ácido fórmico 0,1% para análise de MS. </li></ol> 8. Identificação de proteínas por espectrometria de massa HPLC-coupled <ol><li> 5 mL separado da mistura de peptídeos em um cromatógrafo líquido de alta performance (HPLC) mais de 40 minutos, utilizando um gradiente linear de acetonitrila 20-50% com 0,2% de ácido fórmico em um Pepswift coluna PS-DVB monolítica (Dionex) acoplado a um nanospray I de origem para um espectrômetro de massa ion trap (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) a uma vazão de 400 nL / min na ponta. </li><li> Detectar peptídeo MS1 sinais entre 400-1400 m / z e permitir a três picos de íon mais intenso a ser isolado para MS2 seqüenciamento por CID com a exclusão dinâmica. </li><li> Para identificação de proteínas, analisar os resultados através de um peptídeo Sequest pesquisa de banco de dados do mouse de referência (BioWorks software, Thermo-Fisher Scientific) com uma modificação cisteína estática alquilados e modificações dinâmicas para fosforilação (serina, treonina, tirosina), methylamento (histidina), oxidação (metionina), ADP ribosylation (arginina), e N-terminal acetilação. Aplicar critérios conservadores de correspondência (por exemplo, a tolerância peptídeo definido para 2 AMU e 1,00 tolerância fragmento, proteínas contêm pelo menos 2 peptídeos passar um Xcorr Carga vs Estado de filtro [z = 1 / x = 1,5, z = 2 / x = 2,00, z = 3 / x = 2,50, z = 4 / x = 3,00] e uma probabilidade de p &lt;0,05) 5 manualmente e inspecionar os espectros de MS para a identificação de proteínas confiante. </li></ol> 9. Resultados representativos: Masculino e feminino não exercidas, músculo esquelético murino (bíceps braquial) foi extraído e separado em um mapa bidimensional 5, o primeiro nível do músculo comparativa proteoma (Figura 2). Uma vez visualizada usando alta resolução de imagem digital; cerca de 800 spots de proteínas foram detectadas em cada um. Usando o mapa do sexo masculino proteoma como linha de base, é claro que existem inúmeros pontos que a mudança em abundância no proteoma do sexo feminino. As intensidades de ponto são<html> medidas da mudança nos valores de proteína (Figura 3). As identidades dos spots de proteínas que mudam mais de duas vezes (para cima ou para baixo) e são estatisticamente significativos (p &lt;0,05) com um n = 5 camundongos, são determinados por análise de seqüência de aminoácidos por espectrometria de massa de cromatografia líquida acoplada. Estes resultados mostram que as mulheres demonstram um decréscimo abundância em enzimas de açúcar metabolismo energético e na enzima creatina quinase (CK) isoformas, um sistema de fornecimento de energia em diferentes músculos. Seres humanos e animais mostram maior sexo masculino níveis séricos de CK em repouso e exercício seguinte 9,10, mas os níveis séricos de CK não necessariamente correlacionado com a quantidade de perturbação miofibrilar 11,12. Este dimorfismo de gênero na abundância celular da CK no músculo bíceps braquial murino é uma novela finding5 e pode responder à fisiologicamente diferentes níveis séricos de CK. Números: g1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Um esquema geral do protocolo para a proteômica comparativa. O protocolo está subdividido em três grupos: preparação de amostras, análise de amostra e, identificação de proteínas. As extremidades de cada um destes três grupos de protocolos também são razoáveis ​​lugares pausa, embora os melhores resultados são garnered se o protocolo geral é realizada sem parar. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig2.jpg" /> Figura 2. Comparação de proteína murina bíceps braquial feminino pontos em relação aos pontos idênticos em bíceps braquial do sexo masculino (verde círculos o). Spots de que o aumento maior ou igual a duas vezes nas fêmeas estão circulados vermelho (o) e aqueles que diminuíram menos do que ou igual a duas vezes estão circulados azul (o). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig3.jpg" /> Figura 3 Análise Gel Intensity Spot:. Eixo X, do sexo femininopré-exercício (controle, n = 5); eixo Y, única fêmea luta 0 grupo de pontos de tempo h (n = 5). Linha de regressão: coeficiente de correlação = 0,919; inclinação = 0,976; interceptar = -0,0293. Pontos acima da linha vermelha e abaixo da linha azul mudar mais de + / - duas vezes.

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Não há conflitos de interesse declarados.

A LC / MS proteômica método aqui apresentado é um protocolo mais confiável e reprodutível para uma rápida análise do primeiro nível do proteoma do músculo esquelético. Que permite uma comparação razoavelmente expediente da especificidade de gênero. Proteínas baixa abundância exigiria um fracionamento da amostra do músculo para eliminar o maior número de proteínas contráteis quanto possível, aumentando assim as proteínas pouco abundantes. Adaptando o perfil proteoma pode ser realizado com diferentes pH tiras gama IPG e géis de gradiente alternativo percentual, se desejar. Mais sensíveis manchas fluorescentes existe, mas é recomendável que cada laboratório determine a linearidade destas manchas em seu sistema. Para uma análise mais rigorosa de expressão da proteína do sistema DIGE (bidimensional In-Gel sistema de eletroforese, a GE Healthcare Life Sciences) pode ser usado, no entanto, este não adiciona um nível de complexidade da metodologia. Além disso, o protocolo aqui descrito pode ser usado com a maioria dos animal tecidos para os quais um genoma foi seqüenciado, bem como de seqüenciamento de novo de uma proteína a partir de qualquer fonte, desde que ele pode ser resolvido em um gel de duas dimensões, uma vez que se sobrepõem fragmentos enzimática pode ser gerado usando enzimas de elevada pureza, além à tripsina. Amostras a partir de fontes de outros tecidos pode exigir algumas alterações na metodologia de extração, especialmente se procurar proteínas da membrana e hidrofóbicas, no entanto, temos tido bons resultados usando este protocolo com cardíacas, fígado, rim e tecidos cerebrais. Outras modificações pós-traducionais podem ser detectados através da modificação do espectro de massa critérios de pesquisa do banco de dados. Em suma, temos apresentado um protocolo razoavelmente detalhadas inicial para análises de proteoma.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Tipo </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> PepClean C-18 Giro Colunas </td><td> Consumível </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> PI-89870 </td><td></td></tr><tr><td> Pepswift monolítica coluna (100um x 5 cm) </td><td> Consumível </td><td> Dionex </td><td> 162348 </td><td></td></tr><tr><td> Critério de pré-moldados 10,5% -14% Tris-HCl SDS géis de poliacrilamida </td><td> Consumível </td><td> BioRad </td><td> 345-0106 </td><td></td></tr><tr><td> Readystrip tiras IPG </td><td> Consumível </td><td> BioRad </td><td> PH variando faixas </td><td></td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> A465-1 </td><td></td></tr><tr><td> Acetona </td><td> Reagente </td><td> Pharmco </td><td> 329000 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrila </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> A955 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Reagente </td><td> BioRad </td><td> 163-2111 </td><td> Overlay solução </td></tr><tr><td> Bicarbonato de amônio </td><td> Reagente </td><td> Fluka </td><td> 40867 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP114 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Lyte Ampholytes </td><td> Reagente </td><td> BioRad </td><td></td><td> PH variando faixas </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Reagente </td><td> USB </td><td> 13361 </td><td></td></tr><tr><td> Commassie blue R-250 </td><td> Reagente </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> 20278 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitol (TDT) </td><td> Reagente </td><td> USB </td><td> 15395 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido fórmico </td><td> Reagente </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> 28905 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6279 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina </td><td> Reagente </td><td> USB </td><td> 16407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Iodoacetamida </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6125 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452 </td><td></td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> Reagente </td><td> BioRad </td><td> 163-2129 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecil sulfato de sódio </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> Tris base de </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 93349 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [2-carboexyethyl] fosfina </td><td> Reagente </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> 77720 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina Endoproteinase, TPCK tratado, grau MS </td><td> Reagente </td><td> Perfurar </td><td> 90055 </td><td> modificado </td></tr><tr><td> Uréia </td><td> Reagente </td><td> USB </td><td> 75826 </td><td></td></tr><tr><td> Água </td><td> Reagente </td><td> Burdick &amp; Jackson </td><td> 365 </td><td></td></tr><tr><td> Concentrador CentriVap </td><td> Tool </td><td> Labconco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exquest cortador local </td><td> Ferramenta </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LCQ Deca XP Max ion espectrômetro de massa armadilha </td><td> Ferramenta </td><td> ThermoFisher Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Motorizada pilão </td><td> Ferramenta </td><td> Kontes Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polipropileno mexendo </td><td> Ferramenta </td><td> BioSpec Prod </td><td></td><td></td></tr><tr><td> varas </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PROTEAN célula IEF </td><td> Ferramenta </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sonicador </td><td> Ferramenta </td><td> Branson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Além disso Surveyor HPLC sistema </td><td> Ferramenta </td><td> ThermoFisher Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> VersaDoc imagem sistema </td><td> Ferramenta </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

skeletal muscle gender dimorphism from proteomics

Contração bruta no músculo esquelético é determinado principalmente por um número relativamente pequeno de proteínas contráteis, no entanto, este tecido é também extremamente adaptáveis ​​a fatores ambientais, tais como uma hipertrofia por meio de exercícios de resistência e atrofia por desuso. É, assim, apresenta remodelação e adaptação ao stress (calor, isquemia, metais pesados, etc.) 2,3. Podem ocorrer danos ao músculo por uma força muscular exercendo ao mesmo tempo o alongamento, o chamado 4 contração excêntrica. As proteínas contráteis pode ser prejudicada em tais esforços e precisa ser reparado, degradadas e / ou ressintetizamos; estas funções não fazem parte das proteínas contráteis, mas de outras proteínas muito menos abundante na célula. Para determinar qual subconjunto de proteínas está envolvida na melhoria deste tipo de dano, um proteoma global deve ser estabelecida antes do exercício 5 e seguido, após o exercício para determinar o diferencialexpressão da proteína e, assim, destacar proteínas candidato nas adaptações ao dano e sua reparação. Além disso, a maioria dos estudos do músculo esquelético têm sido realizados sobre o macho da espécie e, portanto, pode não ser representativa do músculo feminino. Neste artigo apresentamos um método para extrair proteínas reproduzível dos músculos masculinos e femininos, e separando-os por eletroforese bidimensional em gel seguido de alta resolução de imagem digital 6. Isto fornece um protocolo para spots (e proteínas posteriormente identificado) que mostram uma diferença estatisticamente significativa (p &lt;0,05), duas vezes aumentar ou diminuir, aparecer ou desaparecer a partir do estado do controle. Estes são, então, excisadas, digeridos com tripsina e separados por alta pressão cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa (LC / MS) para identificação de proteínas (LC / MS / MS) 5. Esta metodologia (Figura 1) pode ser usado em muitos tecidos com pouca ou nenhuma modificação (fígado, cérebro, ouvirt etc.).

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Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Um conjunto simples e direta de métodos para isolar e determinar a identidade das proteínas mais abundantes expressa no músculo esquelético. Cerca de 800 spots são discernidos em um gel de duas dimensões de 10 mg do músculo, o que permite a determinação de gênero específico expressão da proteína. Esses métodos produzem resultados equivalentes na maioria dos tecidos.

Dimorfismo Sexo músculo esquelético de Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

skeletal-muscle-gender-dimorphism-from-proteomics

Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K visualizações.  Smith College. Um conjunto simples e direta de métodos para isolar e determinar a identidade das proteínas mais abundantes expressa no músculo esquelético. Cerca de 800 spots são discernidos em um gel de duas dimensões de 10 mg do músculo, o que permite a determinação de gênero específico expressão da proteína. Esses métodos produzem resultados equivalentes na maioria dos tecidos.

Vídeo: Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

Myo-mecânico Análise do músculo esquelético isolado

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Medicina

Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. Although originally developed and used extensively in the rat due to its larger size, the tibial nerve in mice is big enough that it can be easily manipulated with either crush or transection, leaving the peroneal and sural nerve branches of the sciatic nerve intact and thereby preserving their target muscles. Thus, this model offers the advantages of inducing less morbidity and impediment of ambulation than the sciatic nerve transection model and also allows investigators to study the physiologic, cellular and molecular biologic mechanisms regulating the process of muscle atrophy in genetically engineered mice. The tibial nerve supplies the gastrocnemius, soleus and plantaris muscles, so its transection permits the study of denervated skeletal muscle composed of fast twitch type II fibers and/or slow twitch type I fibers. Here we demonstrate the tibial nerve transection model in the C57Black6 mouse. We assess the atrophy of the gastrocnemius muscle, as a representative muscle, at 1, 2, and 4 weeks post-denervation by measuring muscle weights and fiber type specific cross-sectional area on paraffin-embedded histologic sections immunostained for fast twitch myosin.

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of skeletal muscle atrophy. The model surgical protocol is described and demonstrated in C57Black6 mice. &#160;

Secção do nervo tibial - um modelo padronizado para denervação induzida por atrofia muscular em ratos

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

Procedimentos de biópsia de músculo esquelético humano, utilizando a técnica Bergström Modificado

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

Quantitativa Ressonância Magnética da doença do músculo esquelético

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is estimated to contribute to 19- 25% of all clinical cases of acute kidney injury (AKI) in critically ill patients. AKI detection has historically relied on metrics such as serum creatinine (sCr) or blood urea nitrogen (BUN) which are demonstrably inadequate in full assessment of nephrotoxicity in the early phase of renal dysfunction. Currently, there is no robust diagnostic method to accurately detect hemodynamic alteration in the early phase of AKI while such alterations might actually precede the rise in serum biomarker levels. Such early detection can help clinicians make an accurate diagnosis and help in in decision making for therapeutic strategy. Rats were treated with Cisplatin to induce AKI. Nephrotoxicity was assessed for six days using high-frequency sonography, sCr measurement and upon histopathology of kidney. Hemodynamic evaluation using 2D and Color-Doppler images were used to serially study nephrotoxicity in rats, using the sonography. Our data showed successful drug-induced kidney injury in adult rats by histological examination. Color-Doppler based sonographic assessment of AKI indicated that resistive-index (RI) and pulsatile-index (PI) were increased in the treatment group; and peak-systolic velocity (mm/s), end-diastolic velocity (mm/s) and velocity-time integral (VTI, mm) were decreased in renal arteries in the same group. Importantly, these hemodynamic changes evaluated by sonography preceded the rise of sCr levels. Sonography-based indices such as RI or PI can thus be useful predictive markers of declining renal function in rodents. From our sonography-based observations in the kidneys of rats that underwent AKI, we showed that these noninvasive hemodynamic measurements may consider as an accurate, sensitive and robust method in detecting early stage kidney dysfunction. This study also underscores the importance of ethical issues associated with animal use in research.

Early stage hemodynamic dysfunction is critical to the development of kidney disease. Yet, detection methodologies are limited. Recent advances in sonography provide a noninvasive, accurate option for early detection of kidney injury. This study outlines a step-by-step, sonographic methodology for detecting kidney dysfunction using a drug-induced nephrotoxicity rat model.

Detecção precoce de Induzida por Medicamentos Renal hemodinâmica Disfunção Usando ultrassonografia Tecnologia em Ratos

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

Avaliação ultra-som base de Artéria Coronária Flow e Fluxo Coronariano Reserve Usando o modelo de sobrecarga de pressão no Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

Humano<em&gt; vasto lateral</em&gt; Biópsia de músculo esquelético Usando o Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery in humans. Herein we discuss the design of an eccentric exercise protocol to induce damage in the quadriceps muscles, marked by changes in strength, soreness, and plasma creatine kinase levels. This method is simple, ethical, and widely applicable since it is performed in human participants and eliminates the interspecies translation of the results. Subjects perform 300 maximal eccentric contractions of the knee extensor muscles at a speed of 120&#176;/sec on an isokinetic dynamometer. The extent of the damage is measurable using relatively non-invasive isokinetic and isometric measures of strength loss, soreness, and plasma creatine kinase levels over several days following the exercise. Therefore, its application can be directed to specific populations in an attempt to identify mechanisms for muscle adaptation and regeneration.

This article describes a safe and reliable method to induce and quantify exertional skeletal muscle damage in human subjects.

Indução e Avaliação da Exertional lesão muscular esquelético em humanos

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...