The authors have nothing to disclose.

Este estudo foi realizado de acordo com as políticas estabelecidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH), aprovado pelo Comitê de Ética do Irã Universidade de Ciências Médicas (Teerão, Irão). 1. Os animais, cirurgia e Specimen Preparações NOTA: Prepare o tecido cerebral para análise microscópica confocal 3D. <ol><li> Divida os animais aleatoriamente em dois grupos: Ap 1-40 -injection (n = 8), e Ap 1-40 -injection tratamento com genisteína (n = 8); administrar a genisteína (10 mg / kg, diluída em um veículo tal como óleo de rícino polietoxilado) por gavagem 1 hora antes da cirurgia. </li><li> Anestesiar os animais com cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Confirme anestesia adequada por falta de reflexo de retirada depois de beliscar o dedo do pé. Use pomada nos olhos durante a cirurgia para prevenir o ressecamento. </li><li> Coloque animais no aparelho estereotáxico e cabeça de barbear. Aplicar iodINE solução para limpar o couro cabeludo antes da incisão e manter o local da operação estéril durante a cirurgia para reduzir o risco de infecção. Injectar Ap 1-40 estereotaxicamente (4 ul) no hipocampo a -3,5 mm posterior ao bregma, ± 2 mm lateral à linha média, e -2.8 mm abaixo da dura-máter, de acordo com o atlas de cérebro de rato 8. Para o método estereotáxico por favor veja a publicação anterior 9. </li><li> Fornecer pós-operatório de observação / cuidado até que os animais são totalmente consciente para garantir o conforto dos animais. Mantenha os animais quente durante a recuperação, e não devolvê-los para uma gaiola com outros animais até a recuperação completa. Preste atenção a qualquer sinal de infecção nos animais após a cirurgia. </li><li> Anestesiar os animais profundamente por cetamina (150 mg / kg) três semanas após a cirurgia. Realizar transcardial fixação por perfusão dos animais com solução salina a 0,9%, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS 0,1 M (pH = 7,4), em seguida, remover e corrigir cérebro, tal como descrito em 10 &lt;/ sup&gt;. </li><li> Pós-corrigir os cérebros em paraformaldeído a 4% durante 2-3 dias a 4 ° C. </li><li> Incorporar o tecido em blocos de parafina pelo uso de equipamentos de tecido de incorporação, e evitar sub-enchimento ou sobre-enchimento a cassete, pois pode interferir com o alinhamento ou de corte correta. Prestar atenção à orientação do tecido no bloco de parafina. NOTA: O hipocampo de ratos, por exemplo, está perto de parte posterior do hemisfério cerebral. Assim, o tecido deve ser incorporado em uma forma de seccionamento que começa na parte posterior do cérebro. Utilizar o atlas Paxinos 8 como um guia para alcançar a desejada estrutura anatómica. </li><li> Coloque o micrótomo longe de correntes de ar ou portas desde movimentos aéreos fazer a manipulação de partes mais difíceis. </li><li> Use seções com um de espessura ≥20 como com esta profundidade seja necessário para produzir imagens Z-pilha de astrócitos completos. Não use as primeiras seções casal, como eles podem ter espessura indesejada devido a e térmicaXpansion. </li><li> Coloque as seções sobre a superfície da água quente (5 ± 2 C, abaixo da temperatura de fusão para parafina) apenas o tempo suficiente para achatar as seções. NOTA: Ao longo da secção de expansão pode perturbar a morfologia da estrutura. Use pincel pequeno para transferir cuidadosamente seções. Recolha de dois a três seções em cada slide. </li><li> Armazenar as lâminas em um rack na posição vertical e deixe-os secar a 37 C durante várias horas ou O / N. </li></ol> 2. A imuno-histoquímica <ol><li> Desparafinar secções em xileno, 2 x 10 min, e re-hidratados através de gradiente de álcool (99,8%, 95%, e 70%, 10 min cada) e PBS. </li><li> Incubar com anticorpos contra a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) diluído 1: 1500 em PBS contendo 0,25% de albumina de soro bovino (BSA), 0,25% de Triton X-100 e 3,5% de soro normal (O / N a 4 ° C). </li><li> Lavar as secções em PBS durante 3 x 5 min. </li><li> Incubar com fosfato alcalino antibodie secundário conjugados durante 1 h (1: 100, 21 C, diluiu-se em PBS). </li><li> Lavam-se as secções em PBS durante 3 x 5 min. NOTA: É importante lavar as seções corretamente após anticorpos secundários para minimizar a coloração de fundo. </li><li> Incubar seções na escuridão com líquido Cromógena Red Permanente (15-20 min). Nota: Preparar a solução não mais do que 30 minutos antes do uso. </li><li> Lavar as secções em PBS durante 3 x 5 min. </li><li> Finalmente, os núcleos coram com 4-6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 1: 500, diluído em PBS) antes da cobertura deslizante. Armazenar os slides na geladeira 24-48 h antes de microscopia. </li></ol> 3. Microscopia Confocal NOTA: Para a avaliação quantitativa (ver abaixo), seleccionar um dos astrócitos com um núcleo com manchas de DAPI claramente visível com um mínimo de sobreposição ramos para reduzir o risco de erros. Produzindo imagens Z-Stack é demorado. Seja paciente e não parar durante o processamento. Confocal na vertical a laser microscópio de varredura é used para criar imagens 3D a partir de astrócitos. <ol><li> Coloque o slide no palco microscópio, e selecione o objetivo 63X. </li><li> Abra o software de imagem e clique em sistema Start. Clique na aba Localize. Ir para Atribuir e selecione GFP para ajustar a luz adequada. </li><li> Abra o obturador para refletir a luz. Encontre o refletor Revolver no lado direito do Obturador e escolher a cor que deve ser reflectido pelos astrócitos (verde, vermelho ou violeta); cor vermelha (FSet20 WF) foi utilizado aqui. NOTA: Não se esqueça de focar a imagem diretamente na ocular do microscópio. </li><li> Para encontrar o melhor foco, clique em todas fechadas, colocar o pino microscópio no modo de tela, e clique na guia Acquisition. </li><li> Clique na configuração inteligente sob a guia de Aquisição; uma janela se abre. Selecione o fluoróforo adequado (ou seja, DAPI e Alexa Fluor 555, no projeto atual) da lista. A cor é selecionado automaticamente. </li><li> Clique na melhor sinal, e aplicar, em seguida, clique em Definir Exposição; o computador irá então automaticamente os parâmetros de exposição. </li><li> Para otimizar a imagem, vá para a janela Channels. Desmar Track2, realce Track1 e clique em Live. Foque a imagem, se necessário. </li><li> Na janela Canais ajustar as seguintes chaves; clique no 1AU para otimizar automaticamente o pinhole. É muito importante fazer esta etapa caso contrário, as imagens confocal será não-ideal. Ajuste de Ganho de ter a melhor intensidade (manter essa configuração abaixo de 800 para reduzir o ruído adicional). Finalmente, defina o Ganho Digital entre 2 e 3. </li><li> Desmar Track1, clique em Track2 e repita o Passo 3.8 para Track2. Então pare Live. </li><li> Vá para a janela no modo de aquisição. Melhorar a imagem, otimizando Frame Size e Média. Para mudar tamanho do quadro ir para X * Y e selecione 1024 x 1024. Escolha uma velocidade lenta para criar uma imagem melhor. </li><li> Ir para a Média e selecione um número ≥4. Este valor indica o número de média de exames que serão em média de producè A imagem adquirida. Agora clique no botão Snap, e salvar a imagem em 2D capturado. </li><li> Para geração de imagens 3D, marcar o item Z-Stack em Configuração inteligente fazendo com que a janela Z-Stack para abrir. </li><li> Definir as primeiras e últimas posições para o Z-pilha, isto é, a profundidade da célula. Primeiro, clique em Live. Em seguida, use a unidade de foco do microscópio para se concentrar em sua posição mais elevada de astrócitos no tecido, onde o Z-Stack é começar. Clique em Set First. Em seguida, concentrar até a posição mais baixa do astrócito no tecido, onde Z-Pilha de varrimento deve ser interrompido. Clique em Set Último. Então pare Live. </li><li> Escolha o intervalo; 1,01 uM é utilizado no presente estudo; intervalo de escolha pode ser feito clicando no Optimal para definir o número de fatias. </li><li> Clique em Iniciar Experiment. Salve as imagens uma vez que a verificação for concluída. Esta imagem será utilizada para a medição dos parâmetros seguintes: área superficial e volume de território dos astrócitos, o astrócitos inteiro, incluindo branches, corpo da célula, e núcleo. </li><li> Adquirir uma imagem 2D usando uma objetiva de 10X ou 20X conforme descrito nos Passos 3.6-3.11. Esta imagem pode ser utilizada para a medição da intensidade de fluorescência a imunorreactividade de anticorpos, e a densidade de astrócitos (número / 1.000 mM 2). </li></ol> 4. Astrocyte Densidade e GFAP + Intensidade de Fluorescência <ol><li> Abra a imagem 20X 2D. Clique na Histo (Hisogram) no lado esquerdo da janela da imagem. </li><li> Para calcular a densidade de astrócitos, selecione três campos visuais consecutivos no âmbito do objectivo 20X. Contar o número de astrócitos que exibem uma soma claro com mínima, a sobreposição de ramos nos campos. </li><li> Para quantificar a intensidade de fluorescência, selecione uma ferramenta adequada (retângulo ou círculo) no rodapé da janela de imagem e escolher uma área para a medição. Observe o valor médio eo desvio padrão aparecer automaticamente sob a imagem. No estudo atual, 0,7 mm2 área retangular entre strfoi utilizado iatum e lâmina medial do giro denteado. </li></ol> 5. Ramos astrócitos <ol><li> Para quantificar o comprimento eo número total de sucursais, usar imagens 3D (adquiridos com 20X) no software analisando a imagem. Desenhar uma linha manualmente ao longo do comprimento de cada ramo da astrocyte selecionado. Em seguida, selecione a ferramenta de medição que é especializada para medir a linha de comprimento. Para quantificar o número de agências, selecione a ferramenta de contagem para contar o número de itens selecionados. </li></ol> 6. Volume e Área de Superfície NOTA: A marcação de uma estrutura manualmente em 3D software de análise de imagem requer foco e treinamento. Pratique várias vezes antes de iniciar um experimento. <ol><li> Para quantificar o volume ea área de superfície do núcleo astrócitos, soma, corpo celular e território, transfira as imagens 3D (adquiridos nos Passos 3.1-3.16) para um software de análise de imagens 3D, como Volocity 6.1. </li><li> Abra o software e criar um novobiblioteca. Arraste todas as imagens para a coluna cinza à esquerda na nova biblioteca. Em seguida, selecione uma imagem 3D. À direita, há diferentes canais com cores diferentes. Ligue um canal de interesses; por exemplo, o canal de azul para DAPI quando se mede o núcleo. Alterar o brilho manualmente para obter um contraste ideal. </li><li> Selecione o menu Ferramentas, GO para fazer volume e produzir uma única imagem 3D a partir de imagens Z-stack. Clique em Propriedades no menu Editar e ter certeza de que X, Y e Z propriedades são apresentados; caso contrário, é impossível realizar uma análise 3D. </li><li> Clique no ícone da ferramenta Freehand RIO na barra de ferramentas. Para medir o volume ea área de superfície de astrócitos núcleo a desenhar uma linha ao redor do núcleo marcado com DAPI. </li><li> Para medir o volume ea área de superfície do corpo celular astrocyte a desenhar uma linha ao redor da soma excluindo ramos. </li><li> Para medir o volume ea área de superfície de astrócitos inteiro (corpo celular, incluindo filiais) a desenhar uma linha ao redor da soma após asuperfície de todos os ramos. </li><li> Para avaliar o volume ea área de superfície do território astrocyte a desenhar uma linha entre pontas dos ramos. NOTA: Pressione a tecla Delete no teclado para apagar desenhos indesejados. </li><li> Clique no menu Medições na parte superior da janela de imagem para criar um protocolo de medição; uma janela contendo diferentes ferramentas abre. </li><li> Arraste Encontre objetos para parte superior da janela (painel). Dê um nome descritivo à População 1, selecione a cor associada, e clique em Medida. Outra janela se abre. </li><li> Escolha um parâmetro ou seja, o volume ou a superfície. Clique em OK. Os dados serão exibidos em uma tabela. </li><li> Para salvar os dados clica no menu de medição e selecione Criar item de medição. </li><li> Selecionar um novo item de medida chamada a partir da janela aberta. Em seguida, dê um nome para os dados e clique em OK. </li><li> Finalmente, exportar os dados para software estatísticas, como Graph pad ou excel programa. Use t-teste para analisar os dados, em seguida, traçar 2D grAPHS. </li></ol>

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes:+an+update.">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li><li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis.">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li><li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death/proliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia.">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).</li><li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat.">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079 (2012).</li><li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta(1-40)-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat:+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study.">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526 (2013).</li><li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices.">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li><li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images.">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li><li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury.">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li></ol>

Este trabalho foi financiado por subvenções do Conselho do Condado de Östergötland, (Suécia) e da Celular e Molecular Research Center no Irã Universidade de Ciências Médicas (Teerão, Irão).

No protocolo atual, foram empregados morfometria confocal 3D para avaliar 12 parâmetros diferentes que foram associados com morfologia de astrócitos. Para este efeito, o tecido do hipocampo de ratos com Ap 1-40 - foram usadas astrogliose induzida, com ou sem pré-tratamento genisteína como agente anti-inflamatório. Usando imagens 3D e software de morfometria, fomos capazes de mostrar o efeito da genisteína em astrogliosis ou seja, a morfologia de astrócitos. As alte...

Em saudável o sistema nervoso central (SNC), os astrócitos desempenham um papel importante na regulação do fluxo sanguíneo, o metabolismo energético, função sináptica e plasticidade, e ião extracelular e neurotransmissor homeostase 1-3. Além disso, os astrócitos respondem a diferentes estímulos nocivos e condições anormais, tais como trauma, infecção, ou isquemia neurodegeneração através astrogliose reactivo que é caracterizada por hipertrofia, proliferação e remodelação funcional dos astrócitos 4,5. Astrogliosis reativa pode projetar a resposta inflamatória e processo de reparo no tecido e, portanto, pode afetar o resultado clínico de intervenções terapêuticas. Por conseguinte, os astrócitos têm recebido atenção de neuroscientist durante as últimas décadas, como alvos potenciais para intervenção terapêutica para uma variedade de doenças que afectam o SNC. Os astrócitos têm normalmente uma forma estrelada com o bem-defined ramos que se espalham ao redor da soma 6. Em uma condição de doença no cérebro, ramos de astrócitos tornar complicado e mostram extremidades inchadas 7, por exemplo na presença de beta-amilóide (Ap). Este artigo apresenta um protocolo para a análise de imagens em 3D de astrócitos adquiridos por meio de microscopia confocal. Doze parâmetros quantitativos diferentes para cada astrócitos foram medidas: as áreas de superfície e volumes do território astrócitos (o tecido coberto por uma astrócitos), célula inteira (incluindo filiais), corpo celular e núcleo; o comprimento total e número de agências; a intensidade de fluorescência dos anticorpos utilizados para a detecção de astrócitos; e a densidade de astrócitos (número / 1.000 mM 2). Para este fim, utilizou-se secções do cérebro de ratos expostos a injecção intra-hipocampal de Ap 1-40, com ou sem tratamento genisteína como uma substância anti-inflamatória. O protocolo descrito pode ser usado para uma morfométricaANÁLISE de diferentes tipos de células, in vitro ou in vivo em diferentes condições.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amyloid beta 1-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>79793</td>
			<td>Keep in -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genistein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>446-72-0</td>
			<td>keep in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Permanent Chromogen</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27963</td>
			<td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Perkin Elmer Inc.,</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis 2000</td>
			<td>Tekno Optic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streotaxic apparatus</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad Prism 5</td>
			<td>Graph pad software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

Como as células gliais do cérebro, astrócitos têm diversos papéis funcionais no sistema nervoso central. Na presença de estímulos nocivos, astrócitos modificar suas propriedades funcionais e estruturais, uma condição chamada astrogliosis reativa. Aqui, um protocolo para a avaliação das propriedades morfológicas dos astrócitos é apresentado. Este protocolo inclui a quantificação de 12 parâmetros diferentes ou seja, a área de superfície e o volume do tecido coberto por um astrócito (território do astrócito), toda a astrócito incluindo ramos, corpo da célula, e o núcleo, bem como o comprimento total e o número de ramos, a intensidade de fluorescência imunorreactividade de anticorpos utilizados para a detecção de astrócitos, densidade e astrócitos (número / 1.000 mM 2). Para este efeito tridimensional (3D) imagens microscópicas confocais foram criadas, e software de análise de imagem 3D, tais como Volocity 6.3 foi usado para as medições. Tecido cerebral de ratos expostos a beta-amilóide 1-40 </sub&gt; (Ap 1-40) com ou sem uma intervenção terapêutica foi usado para apresentar o método. Este protocolo pode igualmente ser utilizado para a análise morfométrica 3D de outras células a partir de quer in vivo ou em condições in vitro.

Esta secção apresenta alguns exemplos das observações qualitativas e quantitativas produzidos por análise morfométrica 3D. Para os resultados completos de todos os 12 parâmetros mencionados anteriormente, consulte nossa publicação anterior 10. Observações qualitativos Os astrócitos exibiram ramos finos ou grossos que eram geralmente muito tempo em Aâ 1-40 ratos injectados (Figura 1). Algumas pequenas astrócitos...

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Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K visualizações.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

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Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Análises morfométricas de secções da retina

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Neurociência

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissecção e Cultura do mouse e dopaminérgico do estriado explantes em três dimensões Ensaios matriz de colágeno

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

Tridimensional Confocal análise de marcadores Microglia / macrófagos de polarização em Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure consistent scoring between scorers. This protocol builds off of a need that has arisen from the last two decades of taste research using FP as a proxy for taste pore density. FP density has historically been analyzed using Miller &#38; Reedy&#8217;s 1990 characterizations of their morphology: round, stained lighter, large, and elevated. In this work, the authors forewarned that stricter definitions of FP morphology needed to be outlined. Despite this call to action, follow up literature has been scarce, with most studies continuing to cite Miller &#38; Reedy&#8217;s original work. Consequently, FP density reports have been highly variable and, combined with small sample sizes, may contribute to the discrepant conclusions on the role of FP in taste sensitivity. The Genetics of Taste Lab explored this apparent inconsistency in counting and found that scorers were individually prioritizing the importance of these characteristics differently and had no guidance for when a papilla had some, but not all, of the reported qualities of FP. The result of this subjectivity is highly variable FP counts of the same tongue image. The Denver Papillae Protocol has been developed to remedy this consequence through use of a dichotomous key that further defines and prioritizes the importance of the characteristics put forth by Miller &#38; Reedy. The proposed method could help create a standard way to quantify FP for researchers in the field of taste and nutritional studies.

Here we present a protocol to measure fungiform papilla density from digital photographs. This method builds prioritization and objective characteristic metrics into the original descriptive work on fungiform papillae by Miller &#38; Reedy (1990).

Denver Papilas Protocolo para Objective Analysis de papilas fungiformes

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Modelagem e análise tridimensional da forma de estruturas do cérebro

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

Preparação do tecido cerebral de rato recém-nascido para Análise morfométrica ultraestrutural da distribuição de vesículas sinápticas em terminais nervosos