Este método pode ser usado para facilitar a visualização de processos muito finos de astrócitos para a avaliação de interações neuronais de astrócitos na sinapse durante a doença e estados estáveis. Essa técnica também pode ser aplicada em qualquer modelo de camundongo, população celular ou região cerebral. Para preparar um eletrodo afiado com uma resistência apropriada, puxe um eletrodo de cano único de vidro borossilicato com um filamento em um puxador de micropipette.
Armazene os eletrodos puxados em um recipiente fechado para evitar que a poeira entre nas pontas e mantenha os eletrodos elevados da parte inferior da caixa para evitar que as pontas quebrem. Para encher um eletrodo com solução de corante amarelo lúcifer, coloque um eletrodo na posição vertical com a ponta voltada para baixo, e pipeta de um a dois microliters de solução amarela de lúcifer na parte de trás do eletrodo. Aguarde de cinco a 10 minutos para que a solução se mova para a ponta via ação capilar antes de fixar suavemente o eletrodo preenchido em um suporte de eletrodo conectado a um manipulador com o fio de prata do porta-eletrodos em contato com o amarelo lúcifer dentro do eletrodo.
Para o teste de ejeção de corante, coloque delicadamente uma fatia cerebral levemente fixa em um prato de fundo de vidro preenchido com PBS molar de 0,1 a temperatura ambiente e mantenha a fatia no lugar com uma harpa de platina com cordas de nylon. Conecte o eletrodo a uma fonte de tensão e coloque o eletrodo moído no banho contendo a fatia cerebral. Mova o objetivo de um microscópio confocal para a região de interesse do cérebro e baixe o eletrodo para a solução usando a lente de imersão de água 10X, movendo o eletrodo para o centro do campo de visão.
Sob iluminação de campo brilhante, examine o eletrodo cuidadosamente com a lente de imersão de água 40X para garantir que o eletrodo apareça limpo e sem detritos ou bolhas. Mude para microscopia de varredura a laser confocal com um laser de 488 nanômetros. Ligue o estimulador a 12 volts para testar a ejeção de corante.
Uma grande nuvem de corante fluorescente deve ser visível ao redor da ponta do eletrodo. Em seguida, sob campo brilhante lentamente abaixe o eletrodo em direção à fatia, parando logo acima da superfície. Para preencher um astrócito de interesse com iontopforese, use o contraste de interferência diferencial infravermelha para identificar astrócitos com somata em forma oval alongada de cerca de 10 micrômetros de diâmetro, 40 a 50 micrômetros abaixo da superfície da fatia.
Este é o radiador estrato do hipocampo diretamente abaixo da camada celular piramiada. À medida que nos movemos através do tecido, podemos ver vasos sanguíneos, neurônios, astrócitos e outros tipos de células. Uma vez que um astrócito tenha sido selecionado, mova a célula para o centro do campo de visão e baixe lentamente a ponta do eletrodo na fatia, navegando através do tecido até que o eletrodo esteja na mesma planície que o corpo celular.
Uma vez que o corpo celular do astrócito esteja claramente visível e delineado, devagar e suavemente avance o eletrodo para a frente, movendo o eletrodo até que a ponta empala a soma da célula. Mova o foco do objetivo lentamente para cima e para baixo para notar se o eletrodo está dentro da soma. Uma vez que a ponta do eletrodo esteja dentro da célula, ligue o estimulador a 0,5 a um volts para ejetar continuamente a corrente na célula.
Usando o microscópio confocal, observe a película celular, aumentando o zoom digital para visualizar os detalhes da célula e para garantir que a ponta do eletrodo seja visível dentro da célula, conforme necessário. Aguarde cerca de 15 minutos até que os ramos e processos mais finos pareçam definidos antes de desligar a tensão e retirar suavemente a ponta do eletrodo da célula. Para imaginar a célula preenchida, aguarde de 15 a 20 minutos para que a célula retorne à sua forma original antes de ajustar a configuração do microscópio confocal para garantir que as ramificações e processos mais finos apareçam definidos sob o objetivo de 40X.
Configure uma pilha Z com um tamanho de passo de 0,3 micrômetros, movendo o objetivo durante a imagem até que não haja sinal da célula e defina esse passo como o topo. Em seguida, mova o objetivo para baixo, focando através da célula até que não haja sinal e definir esse passo como o fundo. Após a imagem ser concluída, verifique se o eletrodo é ejeção de corante.
Se aparecer uma grande nuvem de corante, o eletrodo pode ser usado para a próxima fatia. Caso contrário, substitua o eletrodo. Ao gerar uma projeção de intensidade máxima, uma visão detalhada da estrutura de um astrócito em seu domínio pode ser observada.
Um zoom de magnitude X de quatro X no astrócito revela uma projeção de intensidade máxima de um ramo principal, vários ramos secundários, e a distribuição das ramificações e folhetos circundantes. Aqui, a imagem original de um astrócito CA1 é mostrada. O corpo celular, os principais ramos, processos e o volume de território fechados pelo astrócito são reconstruídos nessas imagens subsequentes.
Após a criação das reconstruções, os volumes da soma, célula inteira e território foram quantificados. E o número de grandes filiais foi contado. Como a proteína citoesquelético que rotula filamentos de astrócitos intermediários é expressa na soma celular, ramos principais e alguns ramos de astrócito secundários, mas não nos ramos e processos mais finos.
Nesta análise representativa, não foram encontradas diferenças significativas no número de ramos primários rotulados por proteína ácida fibrilar gliana e aquelas visualizadas por amarelo lúcifer. Além disso, a área celular e o volume do astrócito rotulado por proteína ácida fibrilar glial foram significativamente menores do que a área e o volume visualizado com amarelo lúcifer, demonstrando que a proteína ácida fibrilar gliana é um marcador confiável para rotular os principais ramos, mas não é útil para determinar a área geral ou o volume da célula. A quantidade de corante liberada da ponta do eletrodo depende da resistência ao eletrodo que deve ser alta o suficiente para permitir que um fluxo constante de corante seja ejetado.
Estudos futuros podem examinar os diferentes componentes da estrutura de astrócitos por microscopia leve de super resolução ou por análise imunohistoquímica da expressão de proteínas específicas dentro da estrutura de astrócito.
