Este protocolo ELISA modificado permite a purificação e quantificação precisa de CGRP em plasma humano. Passou por experimentos de validação necessários e pode servir para padronizar futuras metodologias de quantificação. Este protocolo oferece as vantagens de incluir o processamento da amostra antes da degradação significativa da protease, purificação via extração em fase sólida e limitação da ligação não específica pela aplicação de tampão de bloqueio às placas de microtitulação.
CGRP desempenha um papel punitivo na fisiopatologia da enxaqueca e talvez um candidato ao status de biomarcador. Também tem sido implicado em processos cardiológicos, dermatológicos, virais e até mesmo relacionados à COVID-19. Para começar, colete 5 mililitros de sangue total da veia antecubital através dos métodos padrão de punção venosa em um tubo de EDTA vacutainer de 6 mililitros.
Para bloquear a lise do peptídeo alvo, adicionar 0,5 mililitros de inibidor competitivo de serinoprotease de aprotinina. Inverta o tubo 10 vezes e guarde-o no gelo até o próximo passo. Em seguida, centrifugar o tubo a 600 4g por quatro minutos a 4 graus Celsius.
E transfira a fração de plasma para um frasco crio estéril de fundo redondo de 2 mililitros. Armazene imediatamente o frasco para injetáveis de crio a menos 80 graus Celsius durante até duas semanas. Para extrair a amostra de plasma, coloque um cartucho de extração dentro de um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros.
Passe 5 mililitros de metanol 100% e, em seguida, 10 mililitros de água ultrapura através do cartucho para ativá-lo. O fluido será coletado no tubo à medida que passa pelo cartucho por fluxo acionado por gravidade. Descarte o excesso de líquido acumulado para evitar que ele engula o cartucho e garantir que ele não seque durante o experimento.
Diluir 250 microlitros de plasma em 750 microlitros de ácido 4% acético e passá-lo lentamente pelo cartucho. Em seguida, lave o cartucho com 10 mililitros de ácido acético. Uma vez removido o excesso de líquido, transfira o cartucho para um novo tubo centrífugo cônico de 15 mililitros.
Preparar 3 mililitros de solução de ácido acético metanol para eluir o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina ou CGRP. Passe 1 mililitro pelo cartucho e aguarde 25 minutos entre cada eluição e uma eluição entre elas. Após a última eluição o tubo contém 3 mililitros de eluente total.
Transfira 1 mililitro do eluente para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro e gire-o em uma mini centrífuga por um segundo para assentar o eluente. Em seguida, seque a amostra em uma centrífuga a vácuo a 1, 400 RPM e 4 graus Celsius. Imediatamente antes do ensaio, reconstituir a amostra seca com ensaio imunoenzimático descongelado ou tampão EIA.
Para o bloqueio de placas, adicione 250 microlitros de tampão de bloqueio de gelatina de peixe TBS a cada poço. Coloque uma folha de cobertura sobre a placa e incube por duas horas à temperatura ambiente. Após a incubação, retire a folha de cobertura e esvazie a placa invertendo-a.
Em seguida, coloque o prato em um papel toalha para descartar qualquer vestígio de líquido e seque-o em uma capela de fluxo laminar por 10 minutos. Quando a placa estiver visivelmente seca, coloque-a em uma bolsa de papel alumínio selada com um sachê dessecante de sílica gel. Guarde-o a menos 20 graus Celsius por 24 horas.
Antes de realizar o ensaio, descongelar todas as amostras e reagentes preparados à temperatura ambiente. Para enxaguar os poços da placa de bloco, adicione 300 microlitros de tampão de lavagem e deixe descansar por 30 segundos. Em seguida, descarte o tampão de lavagem e repita o enxágue cinco vezes.
Após o último enxágue, borrife a placa conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, distribua 100 microlitros de tampão EIA para os dois poços de ligação não específicos ou NSB dedicados. Adicionar 100 microlitros dos padrões CGRP, seguidos da amostra reconstituída e controle de qualidade em duplicata em poços apropriados.
Adicione 100 microlitros de traçador CGRP a cada poço, exceto os poços em branco. Finalmente, sele a placa usando uma folha de cobertura transparente, garantindo que as amostras e os reagentes não evaporem, e incube a placa por 16 a 20 horas a 4 graus Celsius. Quando o período de incubação terminar, prepare o reagente de Ellman de acordo com as instruções do fabricante.
Uma vez decantada a placa, lave cada poço três vezes, conforme demonstrado anteriormente. Após o último enxágue, agite a placa a 120 RPM por dois minutos. Novamente, enxágue o prato três vezes e seque.
Bata na placa invertida até que o líquido seja visivelmente removido dos poços. Em seguida, adicione 200 microlitros do reagente de Ellman em cada poço, exceto poços em branco. Uma vez coberta a placa, envolva-a em papel alumínio para evitar qualquer exposição à luz e incube-a no escuro à temperatura ambiente por uma hora antes de registrar a absorvância.
O presente estudo demonstrou que a adição da etapa de bloqueio, as taxas de recuperação em cada amostra de espícula de CGRP estavam dentro da faixa aceitável. No entanto, quando a etapa de bloqueio foi excluída, a ligação inespecífica resultou em taxas de recuperação superiores ao limite superior de 125%É importante adicionar aprotinina para armazenar amostras de sangue logo após a coleta para limitar a degradação do CGRP. Além disso, o tampão de bloqueio deve ser adicionado à placa de microtitulação antes do ELISA para reduzir ainda mais a ligação inespecífica.
Assim, este protocolo pode ser utilizado para explorar a candidatura do CGRP como um biomarcador para enxaqueca vestibular, quantificando os níveis de CGRP no plasma de pacientes com migrânea e enxaqueca vestibular versus controles.
