Sensibilidade da membrana mitocondrial interna para na⁺ revela piscinas de COQ funcionais parcialmente segmentadas

Este protocolo destaca o papel do sódio como segundo mensageiro e também mostra a existência de piscinas de ubiquinol parcialmente diferenciadas. Esta técnica demonstra uma abordagem extremamente simples para o estudo de piscinas de ubiquinol que de outra forma requer modelos celulares muito específicos. Esta abordagem pode ser usada para o estudo da transferência de elétrons em outras membranas, particularmente de enzimas dentro de gotas lipídicas.

Divida as amostras em quatro subamostras de 20 microgramas cada e rotule-as de A a D.Split amostras A e B em duas subamostras de 10 microgramas cada e rotule-as como A1, A2, B1 e B2. Prepare o buffer C1/C2 conforme descrito no protocolo de texto e pré-aqueça a 37 graus Celsius. Em um cuvette de um mililitro, adicione cada uma das subamostras a 30 microlitadores de citocromo c e 10 microliters de malonato. Adicione o buffer C1/C2 para aumentar o volume para 980 microliters nas cuvetas A1 e B1 e 979 microliters em A2 e B2. Adicione 10 microlitres de cloreto de potássio de um molar nas cédonas A1 e A2 e 10 microlitrais de cloreto de sódio de um molar em B1 e B2. Adicione um microliter de rotenona de um mililitro nas cuvetas A2 e B2. Logo antes da medição, adicione 10 microliters de NADH de 10 mililitros em todas as cuvetas.

Vire a cuvette três vezes e coloque-a no espectotúmetro. Um software anexado, clique em Medir em parâmetros e, em seguida, vá para Geral e defina os parâmetros de medição em comprimento de onda de 550 nanômetros e tempo em quatro minutos de leitura. Clique em OK e Comece a iniciar o experimento.

No final da medição, salve a inclinação que compreende o aumento linear da absorvância clicando em File e Save As.Split amostras C e D em duas subamostras de 10 microgramas cada e rotulá-los como C1, C2, D1 e D2. Misture cada uma das subamostras em uma cuvette de um mililitro com 30 microlitadores de citocromo c e um microliter de rotenone. Adicione o buffer C1/C2 pré-aquecido a 37 graus Celsius para aumentar o volume para 980 microliters nas cuvettes C1 e D1 e 970 microliters em C2 e D2. Adicione 10 microlitres de cloreto de potássio de um molar nas cédonas C1 e C2 e 10 microliters de cloreto de sódio de um molar em D1 e D2. Adicione um microliter de antimicina de um mililitro A nas cuvetas C2 e D2 logo antes da medição e 10 microlitres de succinato de um molar em todas as cuvetas. Vire a cuvette três vezes e coloque-a no espectotúmetro.

Realize a medição e salve a inclinação que compreende o aumento linear da absorvência no final da medição. Este protocolo foi utilizado para estudar o efeito de íons de sódio na redução do citocromo c por membranas mitocondriais sobre nadh ou adição de succinato. Os traços de absorção gerados a 550 nanômetros para as amostras A e B foram corrigidos para sua inibição correspondente.

Estes traços mostraram uma inclinação semelhante, indicando atividade nadh-citocromo c oxidoreductase semelhante. No entanto, os traços das amostras C e D foram diferentes, mostrando que a atividade de succinato-citocromático c oxidoreductase da amostra C é maior do que a amostra D.In para normalizar a quantidade de mudança medida com essa técnica, outros métodos podem ser realizados ainda mais, como atividade complexa isolada I, complexo II ou complexo III. Usando essa técnica, estamos explorando as configurações fisiológicas em que o sódio pode estar envolvido como um segundo mensageiro.