As respostas celulares aos estímulos externos dependem fortemente do conjunto de proteínas que são expressas na superfície celular em um dado momento. Assim, o número, a localização subcelular e a composição subunidade dessas proteínas são controlados dinamicamente. Aqui, usaremos uma abordagem de alimentação de anticorpos para quantificar o nível de receptores expressos na superfície nas culturas celulares, desde que a internalização e a reciclagem retomem.
Trata-se de um protocolo muito versátil, que fornece informações mecanicistas da regulação das proteínas expressas em superfície. Em nosso exemplo, estudaremos receptores de glutamina em neurônios hipocampais primários. Este protocolo pode ser adaptado a qualquer proteína que possua um epítope extracelular anagênico, se os anticorpos não estão disponíveis, a transvecção de construções marcadas pode ser útil tanto para rotular quanto para estudar mutações específicas.
Em nossos exemplos, usamos anticorpos contra glua1 endógeno, e marcamos Glu12 B.To iniciar este procedimento, transferir a capa desliza lado da célula até uma bandeja coberta de filme de parafina, para salvar reagentes e facilitar a manipulação. Salve e mantenha a mídia condicionada a 37 graus Celsius para incubação e lavagem de passos. Incubar as células com anticorpos primários diluídos em mídia condicionada, em temperatura ambiente, por 15 minutos.
Depois disso, use uma pipeta de vácuo para aspirar cuidadosamente o anticorpo que contém mídia, e lave as células três vezes com mídia condicionada. Se estudar a expressão superficial versus receptor intracelular fixe as células com paraformaldeído após esta etapa, conforme descrito no protocolo de texto. Mantenha as células em mídia condicionada sem anticorpos, e devolva-as à incubadora a 37 graus Celsius para permitir a internalização.
Se estudar o processo de internalização, fixar as células com paraformaldeído após esta etapa, conforme descrito no protocolo de texto. Para bloquear os epítopos do anticorpo primário ligado à superfície, os receptores expressos que não foram internalizados, incubam células com fragmentos de anticorpos anti-IgG fab não julgados diluídos em mídia condicionada, por 20 minutos à temperatura ambiente. Depois disso, lave as células três vezes com mídia condicionada.
Incubar os poços lavados com mídia condicionada contendo 80 dynasores micromolar, a 37 graus Celsius, para permitir a reciclagem de receptores internalizados. Depois de terminar as modificações em células vivas, lave as células uma vez com PBS plus. Adicione uma solução de 4% de paraformaldeído e 4% de sacarose em PBS às células, e incubar em um capô de fumaça à temperatura ambiente por sete a oito minutos, para consertar as células.
Em seguida, lave as células três vezes com PBS regular. Adicione uma solução de soro de cabra 10% normal em PBS às células e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos, para bloquear locais de ligação não específicos. Em seguida, incubar as células com anticorpo secundário fluorescente com marcação fluorescente diluída em 3%NGS em PBS em temperatura ambiente por uma hora, para rotular receptores de rótulos de anticorpos primários.
Depois disso, lave as células três vezes com PBS. Para começar a rotular os receptores intracelulares, adicione uma solução de 0,25% TritonX em PBS e incubar à temperatura ambiente por cinco a 10 minutos, para permeabiliizar as células. Em seguida, bloqueie com 10% de NGS em temperatura ambiente por 30 minutos.
Se estudar superfície versus total, incubar as células com o mesmo anticorpo primário usado anteriormente, diluído com 3%NGS em PBS, em temperatura ambiente por uma hora, para rotular os receptores intracelulares. Em seguida, lave as células três vezes com PBS. Etiqueta com segundo anticorpo secundário marcado fluorescentemente, diluído em 3% NGS em PBS, em temperatura ambiente por uma hora.
Depois desta lavagem as células três vezes com PBS. Primeiro coloque suavemente os deslizamentos de cobertura, lado da célula para baixo, em 12 a 15 microliters da mídia de montagem apropriada para montar as células. Em seguida, imagem as células no microscópio confocal apropriado, e analisar as células como descrito no protocolo de texto.
Este protocolo para estudar o tráfico de receptores de glutamato baseia-se na rotulagem diferencial dos receptores, expressos na superfície celular, e aqueles expressos em membranas internas. Após a aquisição de imagens confocal, o sinal fluorescente pode ser facilmente quantificado para mostrar um aumento na expressão da superfície, em relação à população intracelular, seguindo a LTP química. Nenhum sinal para PSD-95 pode ser obtido em células não permeabilizadas, demonstrando a integridade da membrana plasmática.
Isso indica que o sinal obtido para a superfície GluA1 corresponde de fato aos receptores expressos na superfície. É importante ressaltar que um sinal mínimo para GluA1 internalizado pode ser observado em condições de não permeabilização, mostrando que todos os epítopos de superfície são ocupados pela rodada inicial de rotulagem de anticorpos. Os receptores que foram internalizados são então identificados.
Este exemplo destaca que a fosforilação GluN2B em S1480 promove a internalização do receptor. Como o mutante fosfomimetic S1480E apresentou uma taxa de internalização muito maior em comparação com receptores do tipo selvagem. Como esperado, nenhum sinal é obtido para receptores internalizados no controle.
Em seguida, são identificados receptores reciclados e receptores internalizados. A razão de reciclagem gerada mostra que o GluN2B S1480E não tem efeito na reciclagem do NMDAR. No controle, pode-se observar um sinal forte para o GluN2B expresso na superfície expressa na ausência de bloqueio fab.
Este sinal desaparece nas culturas tratadas pela Fab, demonstrando que o protocolo de bloqueio é suficiente para bloquear completamente os epítopos expressos da superfície, e que os sinais de superfície observados após a reciclagem correspondem de fato aos receptores traficados de volta para a membrana plasmática. O protocolo atual é apenas um dos métodos disponíveis para estudar a regulação de proteínas expressas em superfície. Outras abordagens podem ser tomadas para expandir ou verificar os dados obtidos aqui.
Estes incluem métodos bioquímicos, como biotinilação, técnicas de imagem de vida ou abordagens funcionais, como eletrofisiologia ou imagem de cálcio. Usamos PFA para congelar a localização de receptores, porém o PFA é um cancerígeno conhecido, por isso é crucial executar etapas usando PFA sob um capô de fumaça, enquanto usa EPI apropriado.
