O protocolo oferece um método simples para purificar motores moleculares ativos usando o sistema de baculovírus Sf9. Ele também detalha a motilidade de molécula única e ensaios de deslizamento multimotor para estudar o mecanismo regulador das proteínas motoras. Toda essa expressão vetorial tradicional de baculovírus Sf9 e purificação de afinidade de passo único, levará a proteína motora pura e ativa a estudar os detalhes mecanicistas das cinesinas superprocessivas em sistemas monomoleculares e multimotores.
Além dos motores Kinesin, o protocolo pode ser aplicado para estudar as propriedades bioquímicas e biofísicas de outras proteínas à base de citoesqueleto, como a dionina e a miosina. O protocolo é detalhado e fácil de seguir. Algumas sugestões são manusear as células Sf9 com cuidado, pois são propensas à contaminação, e seguir as notas fornecidas no protocolo.
A demonstração visual é altamente eficaz, fácil de seguir e entender as etapas críticas, especialmente para aqueles que nunca realizaram esses ensaios. Demonstrando o procedimento estarão Pushpanjali Soppina e Dipeshwari Shewale, estudantes de doutorado que trabalham comigo e Pradeep Naik. Para começar, semeie as células em um prato de 35 mililitros, a uma densidade de 4,5 vezes 10 para a quinta célula por mililitro.
Após 24 horas, misture um micrograma de DNA bacmid e 100 microlitros de meio de Grace não suplementado em um tubo. Misture seis microlitros de reagente de transfecção em outro tubo com 100 microlitros de meio de Grace não suplementado. Transfira cuidadosamente o conteúdo do primeiro tubo para o segundo tubo.
Misture-os e incube a mistura por 45 minutos à temperatura ambiente. Adicione 0,8 mililitros de meio Grace não suplementado à mistura. Misture e aspirar a mídia Sf900 SFM das células.
Adicione o meio de transfecção preparado gota a gota no topo das células e incube a placa por seis horas. Em seguida, remova cuidadosamente a mistura de transfecção. Adicione dois mililitros de meio SF900 SFM e incube ainda mais a 28 graus Celsius por 48 horas.
Em seguida, verifique a expressão da proteína motora sob um microscópio de fluorescência invertida. Colha o meio com células infectadas e gire por cinco minutos, a 500 G.Colete o sobrenadante e congele as alíquotas. Adicionar 10 mililitros de meio SF900 SFM com células e um mililitro de estoque de vírus P-zero, em um balão cônico estéril de 100 mililitros.
Incubar a 28 graus Celsius com agitação constante a 90 rpm. Após 72 horas, gire as células em um tubo cônico estéril de 15 mililitros a 500 G por cinco minutos e colete o sobrenadante. Para a expressão de proteínas em larga escala, infecte 30 mililitros da cultura de suspensão com um mililitro de P1 do vírus de estoque.
72 horas após a infecção, verifique a expressão proteica das células e colete as células em tubos cônicos estéreis de 50 mililitros. Depois de girar, descarte o sobrenadante e colete o pellet celular. Para lisar as células, adicione três mililitros de tampão de lise gelado ao pellet celular.
Gire o lisado celular a 150.000 G por 30 minutos, a quatro graus Celsius. Recolha o sobrenadante e misture-o com 40 microlitros de resina de afinidade M2 50%ANTI-FLAG. Incubar a mistura a quatro graus Celsius durante três horas com tombo de ponta a ponta.
Agora pellet a resina FLAG girando a 500 G por um minuto a quatro graus Celsius. Lave o pellet de resina FLAG três vezes com o tampão de lavagem gelado. E após a terceira lavagem, drene cuidadosamente o tampão de lavagem.
Em seguida, adicione 70 microlitros de tampão de lavagem contendo 100 microgramas por mililitro de peptídeo FLAG ao pellet de resina e incube durante a noite a quatro graus Celsius, como demonstrado anteriormente. Após a fiação, colete o sobrenadante contendo proteína purificada em um tubo fresco. Prepare uma mistura de polimerização, conforme descrito no manuscrito, e adicione 10 microlitros de tubulina à mistura de polimerização.
Transfira o tubo para um bloco de calor, pré-aquecido a 37 graus Celsius, e incube por 30 minutos. Depois de preparar o tampão de estabilização de microtúbulos, aqueça-o e adicione-o aos microtúbulos polimerizados. Uma vez que a câmara da célula de fluxo de motilidade é preparada, flua 30 microlitros de solução de microtúbulos diluída através da câmara.
Após 30 minutos, vazar de 40 a 50 microlitros de tampão de bloqueio e incubá-lo. Prepare uma mistura de motilidade e adicione um microlitro do motor purificado a ela. Misture bem e flua a solução para a câmara de motilidade.
Sele ambas as extremidades da câmara de motilidade e a imagem sob iluminação TIRF. Concentre-se nos motores individuais marcados com mCitirine, movendo-se processivamente. Misture a rodamina marcada com tubulina não marcada na proporção de um para 10.
Após 30 minutos de polimerização, adicione suavemente 30 microlitros de tampão de estabilização de microtúbulos pré-aquecido e incube ainda mais, por cinco minutos, a 37 graus Celsius. Corte os microtúbulos pipetando com a ponta de carga capilar. Após o preparo da câmara de fluxo de motilidade, vaze 50 microlitros de nanocorpos de GFP purificados por Sf9 e incube por 30 minutos.
Bloqueie a superfície deslizante da tampa fluindo 50 microlitros de buffer de bloco. Prepare 50 microlitros da mistura do motor. Fluidifique-o para a câmara depois de misturar suavemente a solução e incubar durante 30 minutos.
Lave a câmara, duas vezes, com 50 microlitros de P12-caseína. Prepare a mistura de ensaio de deslizamento e misture-a suavemente, antes de fluir para a câmara de motilidade. Sele as extremidades da câmara de motilidade e visualize o deslizamento dos microtúbulos sob iluminação TIRF.
Após 48 horas de transfecção, as células não transfectadas parecem pequenas, redondas e firmemente ligadas. No entanto, as células transfectadas que expressavam proteína, estavam frouxamente ligadas à superfície e apresentavam diâmetro celular aumentado. Após 72 horas, mais de 90% das células Sf9 expressaram KIF1A motoras de cinesina-3 marcadas fluorescentemente e células foram frouxamente ligadas à superfície.
A proteína motora Kinesin-3 foi purificada a partir das células Sf9 transfectadas. O quimógrafo mostra o motor de cinesina-3 caminhando processivamente, ao longo da superfície dos microtúbulos. Os eventos de motilidade mostraram velocidade média e comprimento de corrida de aproximadamente 2,44 micrômetros por segundo e 10,79 micrômetros, respectivamente.
O quimógrafo indica deslizamento suave de microtúbulos pelos motores de cinesina-3, com uma velocidade média de aproximadamente 1,37 micrômetros por segundo. O mais importante é adicionar o tampão de estabilização sem perturbar a mistura de microtúbulos e não cisalhar o microtúbulo. O protocolo seria útil para outras aplicações, como medições de ATPase, análise biofísica, mecanismos, ensaios de reconstituição in vitro, etc.
Usando motores purificados sf9, demonstramos recentemente que os motores de cinesina-3 são rápidos e superprocessivos. Curiosamente, esses motores exibem altas taxas de rotatividade de ATP em comparação com o motor bem caracterizado, Kinesin-1.
