Nosso protocolo foi projetado para sondar os mecanismos biofísicos que regem o transporte de carga por equipes de proteínas motoras citoesqueletal idênticas ou opostas. Usando origami de DNA para construção molecular, este método pode escolher o tipo, número e localização dos motores em formas de carga precisamente definidas. Embora este protocolo se concentre nos motores baseados em microtúbulos dynein e quinase, ele é adaptável à miosina motora baseada em actina, bem como a outros sistemas proteicos que funcionam cooperativamente.
Um aspecto desafiador deste protocolo é manter a integridade e a atividade das proteínas motoras durante todo o processo de purificação, pois são sensíveis ao calor e à força mecânica. Para induzir o crescimento e a expressão da proteína motora através do promotor galactose, use uma varinha de inoculação estéril para esticar a levedura congelada de interesse em uma placa de cultura levedura-peptone-dextrose para uma incubação de três a quatro dias a 30 graus Celsius. No quarto dia da cultura, quando a densidade óptica em 600 nanômetros está entre 1,5 e 2, recolhe as células de levedura por centrifugação, e resuspensa a pelota na água para lavá-las e consolidar as células em uma única garrafa.
Gire as células novamente para coleta, e resuspense a pelota em cerca de dois mililitros de água duplamente destilada. Em seguida, use uma pipeta de 10 mililitros para distribuir lentamente o chorume celular em nitrogênio líquido uma gota de cada vez para produzir pelotas de células de levedura congeladas. Para purificação de proteínas motoras, use um moedor de café do tipo lâmina pré-refrigerado com nitrogênio líquido para moer as pelotas de levedura congelada em um pó fino, e transfira o fermento em um béquer de vidro pré-refrigerado, de 100 mililitros, no gelo.
Adicione um pequeno volume de tampão de lise 4X recém-preparado com suplementos ao pó para que a concentração final do buffer não exceda 1X, e coloque o béquer em um banho de água Celsius de 37 graus com agitação contínua com uma espátula para descongelar rapidamente o pó. Adicione tampão 4X adicional com suplementos para levar a concentração final do buffer para 1X no lysate. O volume final é muitas vezes entre 25 e 30 mililitros.
Em seguida, colete as células de levedura por centrifugação, e transfira a proteína solúvel contendo supernante em um novo tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Para purificação de afinidade IgG, adicione 200 microliter de suspensão de contas de afinidade lavada ao extrato de proteína, e incubar a mistura a quatro graus Celsius por uma hora com rotação suave. No final da incubação, filtre a mistura através da mesma coluna de cromatografia usada para preparar as contas a quatro graus Celsius, seguida por duas lavagens com cinco mililitros de tampão de lavagem por lavagem no gelo.
Após a segunda lavagem, enxágue as contas no gelo com cinco mililitros de tampão TEV, permitindo que o tampão escorra totalmente da coluna. Para rotulagem de oligonucleotídeos de DNA, cape a coluna de cromatografia e incuba as contas motoras com 100 microliters de tampão TEV suplementados com 10 a 20 micromolar do oligo de benzocaína purificada à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos, suavemente ressuse as contas uma vez por minuto. No final da incubação, lave as contas quatro vezes com tampão TEV fresco por lavagem como apenas demonstrado, antes de recapitular a parte inferior do tubo para permitir a ressuspensão das contas motoras em não mais do que 200 microliters de tampão TEV fresco.
Para o decote TEV, transfira a suspensão do motor para um tubo de microcentrifus de dois mililitros, fundo redondo, microcentrifuus e incubar as contas motoras com aproximadamente 0,3 unidades de protease TEV por microliter de mistura de contas motoras a 16 graus Celsius por uma hora com rotação suave. No final da incubação, centrifufique as contas do motor e colete a mistura na parte inferior do tubo. Em seguida, use uma ponta de pipeta P1000 cortada para transferir a mistura para uma coluna de spin, e centrifugar a mistura como apenas demonstrado.
Colete o filtrado contendo os motores tev-cleaved, purificado e alíquota do filtrado em volumes de 50 microliter para purificação de afinidade de microtúbulos. Em seguida, o flash congele as alíquotas em nitrogênio líquido para menos 80 graus Celsius de armazenamento. Para purificação do chassi, no final da tarde do dia anterior à purificação, coloque suavemente 80 microliters cada uma de concentração de glicerol em tampão dobrável de origami em um tubo de centrífuga.
As fronteiras entre as camadas devem ser ligeiramente visíveis. Após uma incubação durante a noite a quatro graus Celsius, camada 10% glicerol em buffer dobrável de origami na solução de chassi dobrado sobre a camada superior do gradiente, e centrífuga o gradiente com o chassi. No final da centrifugação, colete frações de 50 microliteres do gradiente em uma direção de cima para baixo, e carregue cinco microlitadores de cada fração em poços individuais de um gel de 2% de agarose.
Após 90 a 120 minutos a 70 volts, imagem o gel usando condições adequadas para a mancha de gel de DNA usada. Concentrações quantificadas das frações de interesse selecionadas podem ser determinadas usando os métodos espectroscópicos padrão apropriados. A análise SDS-PAGE pode ser usada para confirmar a extração bem sucedida de dynein de levedura, já que o filtrado final mostra uma faixa clara e afiada a aproximadamente 350 kilodaltons.
A protease TEV também está presente no filtrado final e forma uma banda clara em cerca de 50 kilodaltons. Após a purificação da afinidade com microtúbulos, dynein aparece como uma banda clara e única a 350 kilodaltons, enquanto a cinesina pode ser observada como ligeiramente manchada, múltiplas bandas em cerca de 120 kilodaltons. Além da protease TEV, uma quantidade notável de tubulina também pode ser observada no supernanato final.
A dobra das estruturas de origami de DNA pode ser avaliada pela eletroforese do gel agarose, com uma mudança de mobilidade entre o fio puro desdobrado do andaime e a reação dobrável indicando a dobra de origami. Além disso, a reação dobrável indica a presença de alguma multimerização das estruturas do chassi. A motilidade dos conjuntos de chassis motorizados é facilmente detectável e mensurável em kymographs gerados a partir de filmes TIRF, já que os kymogramas de chassis flexíveis conjugados a sete proteínas dynein demonstram corridas altamente processivas em velocidades relativamente consistentes.
É vital controlar cuidadosamente a temperatura das proteínas motoras em cada etapa do procedimento. Após a purificação das proteínas motoras e do chassi de origami de DNA, os dois componentes podem ser conjugados para ensaios de motilidade dos conjuntos sob um microscópio TIRF. Este método permite que os mecanismos biofísicos e bioquímicos que regem a motilidade emergente dos conjuntos motores sejam decifrados.
