O Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 é uma proteína motora bidirecional. Cin8 se move na direção de extremidade inferior dos microtúbulos como uma única molécula, e muda a direcionalidade sob uma série de condições experimentais diferentes. O objetivo geral de nossa pesquisa é entender o mecanismo da motilidade bidirecional, estudando fatores e elementos estruturais que regulam a motilidade bidirecional do Cin8.
Este protocolo explica de forma abrangente a purificação do Cin8 de comprimento completo do tipo GFP superexpresso em células de levedura, o ensaio de motilidade de molécula única e a análise subsequente das propriedades motile de moléculas únicas e aglomerados de Cin8. Essa separação é importante, uma vez que a direcionalidade do Cin8 é afetada pelo seu acúmulo em aglomerados no microtúbulo. Esta técnica pode ser facilmente adaptada para purificar outras proteínas nucleares da levedura.
Além disso, pode ser aplicado a quaisquer partículas fluorescentes que precisam ser separadas em grupos de tamanho com base em sua intensidade de fluorescência. A demonstração do procedimento serão a Dra. Tatiana Zvagelsky, Mayan Sadan e Shira Hershfinkel, estudantes de pós-graduação;e Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham e Meital Haberman, estudantes de graduação do nosso laboratório. Para começar, cresça as células de saccharomyces cerevisiae contendo o plasmídeo para superexpressão de Cin8-GFP-6His à fase de crescimento exponencial em um litro de meio seletivo de levedura, complementado com 2% de raffinose a 28 graus Celsius.
Em seguida, induza a superexpressão do Cin8-GFP-6His adicionando 2% de galactose e monitore o crescimento da cultura da levedura medindo a absorvência em 600 nanômetros. Cinco horas após a adição de galactose, colher as células por centrifugação. Suspenda as células no tampão de lise e congele-as em nitrogênio líquido.
Em seguida, usando uma argamassa gelada e pilão, triture as células congeladas em nitrogênio líquido. Continue adicionando nitrogênio líquido durante a moagem, para que os extratos permaneçam congelados. Monitore a lise celular sob um microscópio de contraste de fase ou interferência diferencial.
Então descongele as células moídas e as centrrifuá-las. Carregue o sobrenante em uma coluna de fluxo de gravidade cheia com dois mililitros de Níquel-NTA, e pré-equilibre-o com tampão de lise. Deixe o supernatante fluir através da coluna.
Lave a coluna com cinco volumes de coluna de tampão de lise, seguida por cinco volumes de coluna de tampão de lise suplementado com imidazol de 25 mililitros. Em seguida, elute o Cin8-GFP-6His com tampão de eluição. Analise as amostras elucidadas pelo fracionamento SDS-PAGE, seguido de coloração azul Coomassie e análise de manchas ocidentais sondadas com anticorpo anti-GFP.
Depois de agrupar as frações contendo Cin8-GFP-6His, purifica-as por cromatografia de exclusão de tamanho a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto, e um limite de pressão da coluna de 1,5 megapascals. Monitore simultaneamente a absorvência a 280 nanômetros. Colete as frações correspondentes ao tetramer Cin8-GFP e analise-as por SDS-PAGE e mancha ocidental.
Em seguida, aliquot as frações selecionadas, snap-freeze e armazenar até usar a menos 80 graus Celsius. Para polimerizar e estabilizar os microtúbulos rotulados de biotina e rhodamina, misture os componentes de reação em um tubo de 1,5 mililitro e incubar a mistura por uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 80 microliters de tampão de tubulina geral quente, misture cuidadosamente e centrífuga.
Descarte o supernatante e suspenda cuidadosamente a pelota, escaneando para cima e para baixo com 50 microliters de tampão de tubulina geral quente. Em seguida, armazene a suspensão a 28 ou 37 graus Celsius. Examine os microtúbulos com um microscópio de fluorescência, usando o canal de rhodamina de 647 nanômetros.
Em seguida, remova o papel protetor das tiras de fita e coloque uma mancha de cobertura silanizada nas tiras para criar três câmaras de fluxo de volume de 10 microliter. Em seguida, execute o revestimento de avidin do deslizamento de tampas por adição sequencial dos reagentes indicados. Incubar a tampa por três a cinco minutos antes de lavá-la com 80 microliters de tampão de tubulina geral.
Em seguida, conecte os microtúbulos biotinilados aos deslizamentos revestidos b-BSA/avidin, inserindo 20 microliters de microtúbulos na câmara de fluxo. Incubar os slides com o deslizamento voltado para baixo em uma câmara de umidade escura por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave os slides com 200 microliters de tampão de tubulina geral.
Em seguida, aplique 30 microliters de mistura de reação de motilidade seguido por motores Cin8-GFP diluídos em 20 microliters da mistura de reação de motilidade na câmara de fluxo, e imediatamente proceder à imagem do movimento dos motores ao longo dos microtúbulos. Para a imagem de motilidade motora, coloque uma gota de óleo de imersão no objetivo do microscópio e, em seguida, coloque a câmara de fluxo no estágio do microscópio fluorescente, com o deslizamento de tampa voltado para o objetivo. Ligue o canal de rhodamina para focar nos microtúbulos ligados à superfície do deslizamento de tampas.
Em seguida, usando o software ImageJ Micro-Manager, adquira a imagem com uma exposição de 20 milissegundos. Em seguida, ligue o canal GFP e adquira 90 imagens de lapso de tempo com um intervalo de um segundo e exposição de 800 milissegundos. No software ImageJ Fiji, abra o filme time-lapse e a imagem de campo de microtúbulo correspondente.
Sincronizar essas duas janelas escolhendo Analisar, seguido de Ferramentas e Sincronizar o Windows. Para obter um kymograph, destaque um microtúbulo usando a opção Linha Segmentada. Em seguida, a partir de Analisar, selecione a guia Multi Kymograph.
Para determinar o tamanho do cluster das moléculas Cin8-GFP, realize a subtração de fundo e a correção para iluminação irregular clicando em Processo, seguido de Fundo Subtraído. Defina o raio da bola rolando para 100 pixels e verifique a opção Deslizar paraboloide. Em seguida, rastreie um motor Cin8-GFP não motile específico usando o plugin TrackMate do software ImageJ Fiji.
Escolha Plugins, seguido por Tracking, TrackMate, detector LoG e simple LAP tracker para seguir a intensidade média de fluorescência do motor Cin8-GFP em função do tempo dentro de um círculo de quatro pixels de raio. Depois de repetir o procedimento para diferentes motores Cin8-GFP, plote as intensidades de fluorescência em função do tempo. Em seguida, para acompanhar a motilidade das moléculas Cin8-GFP ao longo das faixas de microtúbulos, lavore os microtúbulos a serem analisados na sequência de lapso de tempo dos quadros gravados, destacando-o com a ferramenta retângulo e clicando imagem, seguido por Crop.
Escolha uma partícula fluorescente Cin8-GFP para a análise. Registo as coordenadas de partículas em cada quadro da sequência de lapso de tempo usando as opções point-lapse e Measure. Da mesma forma, registos para outras partículas fluorescentes na sequência de lapso de tempo.
Em seguida, atribua o tamanho do cluster a todas as partículas Cin8-GFP examinadas no primeiro quadro de sua aparência, como demonstrado anteriormente. Em seguida, utilizando a fórmula indicada e as coordenadas de movimento Cin8-GFP determinadas, calcule os deslocamentos de Cin8-GFP em cada ponto de tempo em relação às coordenadas iniciais. A partir desses valores de deslocamento, calcule o deslocamento para todos os intervalos de tempo possíveis para uma partícula Cin8-GFP especificada.
Repita o procedimento para todas as partículas Cin8-GFP examinadas. Finalmente, plote o deslocamento médio de todas as partículas Cin8-GFP examinadas versus intervalo de tempo, e submá-la a um ajuste linear. A inclinação deste ajuste representa a velocidade média das partículas Motile Cin8-GFP.
As características de motilidade da proteína motora bidirecional Cin8 de diferentes tamanhos de cluster em microtúbulos únicos são mostradas aqui. Para cada categoria de tamanho de cluster, mais de 40 trajetórias de Cin8-GFP individuais foram extraídas das gravações. Traçar os deslocamentos médios de moléculas únicas e aglomerados de motores Cin8 em função do intervalo de tempo demonstrou que as moléculas cin8-GFP se movem de forma unidirecional e sem direção com alta velocidade.
Em contraste, os clusters Cin8 apresentam menor velocidade e maior motilidade bidirecional. Durante a realização deste procedimento, a proteína motora de alta pureza deve ser usada para evitar contaminações que possam afetar o agrupamento motor. Ao analisar a intensidade da fluorescência motora, é importante examinar os motores no primeiro quadro que aparecem, para evitar o efeito do fotobleaching.
Ao estudar a motilidade dos motores bidirecionais, é extremamente importante analisar separadamente moléculas e clusters únicos, pois o agrupamento motor é um dos fatores-chave que afetam a direcionalidade motora.
