O crescimento celular das plantas é controlado pelas propriedades mecânicas de suas paredes celulares. Portanto, é importante conhecer essas propriedades em diferentes órgãos e tecidos das plantas. O método aqui apresentado permite a caracterização biomecânica de paredes celulares não fixas e não desidratadas nos tecidos internos de plantas jovens.
Comece com a preparação das soluções e da amostra para o seccionamento do vibratome. Despeje uma camada de quatro milímetros de 3% de agarose derretida no fundo da placa de Petri e deixe esfriar um pouco para evitar danos térmicos à amostra. Coloque cerca de cinco milímetros de comprimento três ou quatro pedaços do órgão da planta horizontalmente sobre a agarose.
Cerca de 30 a 60 segundos depois, um filme semissólido fino aparecerá no topo da primeira camada de agarose. Em seguida, despeje cuidadosamente uma segunda camada por cima. Depois que a agarose estiver completamente solidificada, corte o bloco que contém o espécime.
Molde o bloco em uma pirâmide truncada hexagonal para garantir sua estabilidade durante o seccionamento adicional. Antes de iniciar a seccionamento da amostra com o vibratome, cole o bloco no estágio vibratório com adesivo de cianoacrilato. Coloque o palco no vibratome, de modo que um dos cantos da pirâmide fique de frente para a lâmina do vibratome e despeje água no banho de vibratome.
Defina os parâmetros de seccionamento, como espessura da seção, velocidade da lâmina e frequência de vibração, e corte a amostra. Usando uma escova fina, mova a seção do banho de água para uma lâmina de vidro e coloque uma gota de água na seção para evitar que ela seque. Depois de verificar a qualidade da seção sob um microscópio de luz, selecione a seção adequada com parede celular perpendicular ao plano de seção.
Em seguida, imobilize a seção para medições de microscopia de força atômica derramando uma camada de um mililitro de agarose derretida a 1% no fundo da tampa da placa de Petri usando uma pipeta. Depois que a agarose se solidificar, remova o excesso de água da seção, trazendo papel de filtro para sua borda. Transfira cuidadosamente a seção do slide para o centro da tampa da placa de Petri usando um pincel.
Em seguida, adicione cuidadosamente 1% de agarose ao redor da seção usando uma pipeta de 20 microlitros e despeje a água ou outra solução para a microscopia de força atômica na tampa da placa de Petri com a seção imobilizada. Guie a amostra sob o cantilever de microscopia de força atômica usando o microscópio óptico. Clique no botão Aproximação e, em seguida, no botão Pouso para se aproximar da amostra no modo de contato com um ponto de ajuste de um nanoampere.
Clique no botão Digitalização e, em seguida, no botão Área. Selecione o tamanho da área de 50 micrômetros por 50 micrômetros para digitalizar. Clique no botão Mover sonda e verifique toda a área de varredura movendo o scanner sobre ela e encontrando o ponto mais alto com base no grau de protrusão do scanner.
Abra a guia Abordagem. Em seguida, clique no botão Remover para se retirar da amostra. Usando o ponto mais alto como alvo, clique no botão Aterrissagem para se aproximar da amostra novamente.
Em seguida, verifique a superfície novamente clicando no botão Mover sonda e movendo o scanner sobre ela. Defina a taxa de varredura para 0,5 hertz e defina o tamanho da varredura para 50 micrômetros por 50 micrômetros e o ponto de varredura para 64 por 64. Clique no botão Executar e digitalize para verificar a superfície da amostra e é possível contaminação com agarose.
Depois de clicar no botão Ativado, escolha o modo HDPlus no menu suspenso na janela principal do programa e defina o ponto de ajuste para 0,1 nanoamperes na janela principal do programa. Na aba principal da janela HD, defina os parâmetros de digitalização apropriados para a amostra estudada. Em seguida, abra a guia Ruídos na janela HD e insira a frequência de ressonância do balanço.
Abra a guia Quant da janela HD e insira o IOS, a rigidez do cantilever, o raio da ponta e o ângulo. Selecione o modelo de contato, que será usado para cálculos dependendo da geometria da ponta. Depois disso, abra a guia Scan da janela HD e selecione os sinais, bem como a direção em que o sinal é gravado.
Marque a caixa Forçar Volume para obter um registro de todas as curvas de força e clique no botão Desligar na parte superior da janela principal do programa para ativar o loop de feedback Clique no botão Phase Core na janela HD principal para corrigir a sensibilidade do sistema óptico. A guia Versus Time da janela HD principal apresenta a função do sinal DFL versus tempo em tempo real. Selecione as partes dessa função que serão usadas para a determinação do nível de linha de base e para ajustar o modelo de contato para cálculos adicionais.
Agora, defina o valor do ponto de verificação para 256 por 256 na janela principal do programa. Em seguida, defina a taxa de varredura para 0,2 hertz e clique no botão Executar para digitalizar a amostra. Depois que a digitalização parar, clique no botão Ativado na parte superior da janela principal para desligar o loop de feedback.
Escolha Modo de contato no menu suspenso, abra a guia Abordagem e clique no botão Remover para se retirar da amostra. Clique no botão Dados para abrir o software de análise e salvar a saída. Abra o arquivo salvo no software de análise.
Selecione o quadro de volume de força HD. Mantenha pressionada a tecla Control e selecione um quadro visual obtido na mesma direção de digitalização. Clique no botão Carregar Mapa Externo para ver onde as paredes celulares estão localizadas.
Verifique os valores de rigidez InvOptSens e cantilever na guia principal. Abra a guia Adicional e verifique os parâmetros de dica e o modelo de contato. Clique em vários pontos nas paredes celulares do quadro visual e selecione apenas as curvas bem descritas pelo modelo.
As áreas brancas no mapa do módulo correspondem a uma superestimação errônea do módulo de Young devido ao scanner atingir seu limite na direção Z. Esta imagem não é conveniente para ser usada como um mapa externo para uma seleção adicional de curvas de força satisfatórias. No entanto, o mapa de sinal DFL apresentado à direita é mais adequado aqui.
Diferentes instrumentos podem se referir a sinais DFL como sinais de deflexão ou erro. O scanner que foi totalmente estendido ao tentar chegar ao fundo da amostra pode resultar em medições errôneas e até mesmo varreduras interrompidas. A presença de agarose pode ser verificada durante a obtenção da primeira varredura no modo de contato, pois as paredes celulares e alguns fundos celulares são visíveis em tais varreduras.
No entanto, em caso de imobilização imprecisa, a superfície pode ser coberta com agarose, que mascara a topografia da amostra. De quatro curvas de força diferentes registradas em diferentes pontos da mesma parede celular, a curva registrada em 0,1 não mostra linha de base, o que significa que não há separação da ponta do cantilever da parede celular. A curva registrada em 0,3 mostra um ombro na parte que se aproxima indicando flexão da parede celular.
Os pontos dois e quatro mostram curvas de força satisfatórias com valores de módulos semelhantes. A preparação da amostra e o exame exigem prática, mas podem ser dominados. Uma parte crucial deste protocolo é filtrar as curvas resultantes.
Não confie em módulos, que foram calculados automaticamente. A mesma técnica pode ser usada para medir as forças de adesão ou dissipação de energia. Também pode ser importante para a descrição do comportamento viscose ou viscoelástico de alguns materiais.
