The authors have no acknowledgements.

1. Poliuretano (PU) Sponge Preparação como Modelo <ol><li> Use esponjas PU para produzir modelos de hidroxiapatita contendo poros comunicantes. Usar cada esponja para fornecer as trabéculas primária para a formação das escoras do molde, bem como a formação de micro-canais dentro de trabéculas. </li><li> Cortar e aparar 80 ppi (poros por polegada) esponjas em 2 ponte-formas com dimensões de 3,5 cm de altura x 5 cm de comprimento x 1,5 cm de largura. Nota: As dimensões e formas podem ser escolhidas de acordo com o tamanho de poro desejado primária: 100 ppi, 80 ppi e 60 ppi. </li><li> Adicione 100 ml de 4% (w / v) de uma solução de NaOH utilizando um copo de 150 ml; em seguida, mergulhar e espremer até que as esponjas preparadas são completamente encharcada. </li><li> Após a imersão, coloque o copo com as esponjas do ultrasonicator (42 kHz). </li><li> Ultrassonicamente pré-tratar as esponjas de PU para 15-20 min sem calor para modificar as propriedades de superfície. </li><li> Enxágüe com água destiladaágua para 5-10 min. Ao lavar, apertar as esponjas e permitir-lhes expandir 5 a 7 vezes a fim de remover o NaOH residual no interior das esponjas. </li><li> Espremer as esponjas com toalhas de papel, a fim de remover o excesso de água; em seguida secá-los num forno a 60-80 ° C. </li></ol> 2. A hidroxiapatita (HA) Slurry Preparação para Revestimento <ol><li> Antes de fazer a suspensão de HA, medir o peso de um copo com uma barra de agitação magnética. Esta medição vai ser utilizado para calcular a relação pó / líquido. </li><li> Medir 10 g de HA em pó tamanho nano. </li><li> Adicionar 20 ml de água destilada no copo de 50 ml. Calor para 120-140 ° C e agitar com um agitador magnético placa quente. </li><li> Adicionar 0,3 g (3% w / w) de álcool polivinílico (PVA) (MW 89,000-98,000) por pó em água destilada com agitação a 300-400 rpm. </li><li> Agita-se até o PVA estar completamente dissolvido. A solução deve ser límpida após a dissolução completa do PVA. </li><li> Vire off o calor e adicionar 0,1 g (1% w / w) de carboximetilcelulose de sódio (CMC) (ultra-baixa viscosidade) em pó enquanto se agitava a 400-500 rpm. A solução deve ser límpida após a dissolução completa do PVA. </li><li> Mexa até que o CMC se dissolva completamente e arrefecer à RT. </li><li> Adicionar 0,3 g (3% w / w) de dispersante de poliacrilato de amónio em pó por agitação a 300-400 rpm. Mexa até dissolver completamente. </li><li> Adicionar 0,2 g (2% w / w) de glicerina por pó enquanto se agitava a 300-400 rpm. Mexa até dissolver completamente. </li><li> Lentamente dispersar o pó de HA na solução enquanto se agitava a 600-900 rpm e manter a agitação durante 5 min. </li><li> Sonicar durante 5 min, utilizando um ultrasonicator para assegurar a dispersão de qualquer aglomeração do pó de HA. </li><li> Adicionar um extra de 5 ml de água destilada para dentro da mistura com agitação a 600-900 rpm e aquece-se a 90-100 ° C. </li><li> Continuar a mexer a mistura utilizando um agitador magnético a 600-800 rpm, a 90-100 ° C em order para evaporar o conteúdo de água. </li><li> Medir o peso inteiro, incluindo o recipiente e mistura ao longo do tempo até uma razão de pó / líquido de 1,75-1,8 é obtido. </li><li> A formatação da relação pó / líquido, dividir a massa do pó e o peso total da mistura (2,14), incluindo o pó, reagentes, e de água, menos o peso da taça e um agitador (2.1), e menos o pó de HA (2.2). Nota: Por exemplo: Se A (mistura em pó inteiro, incluindo, reagentes, e da água) é 49,05 g, B (proveta com agitador) é de 33,5 g, e, em seguida, C (HA pó) é de 10 g. C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80 </li><li> Permitir que a suspensão arrefecer até à temperatura ambiente antes de utilizar para revestimento. </li></ol> 3. HA revestimento, secagem e sinterização <ol><li> Revestir as esponjas preparadas de PU com a suspensão de revestimento de HA utilizando uma espátula de aço inoxidável até a suspensão é homogeneamente distribuído em toda a esponja de PU numa placa de vidro. Nota: Depois de retirar o excesso de injúriary, alguns dos poros ainda pode ser obstruído com pasta devido à alta viscosidade da lama. </li><li> De modo a assegurar a interligação, a uniformidade, e os poros abertos, ligeiramente soprar os modelos HA revestida utilizando um compressor de ar. Este processo garante que os moldes estão homogeneamente revestido tanto nas superfícies interiores e exteriores da esponja de PU. Nota: Se um revestimento homogéneo não é alcançado, os modelos revestidos HA entrará em colapso durante o processo de sinterização e também podem quebrar durante o manuseio devido à baixa resistência mecânica. Além disso, o revestimento homogéneo é crítico na criação de micro-canais dentro de trabéculas. </li><li> Secam-se os modelos de HA revestidas durante um mínimo de 5 horas, sob condições de arrefecimento (20-25 ° C) com circulação de ar suave. No entanto, prolongar o tempo de secagem com base no tamanho do molde. Nota: Após a secagem, os modelos revestidos HA irá encolher tipicamente cerca de 8% a 10% em cada dimensão. </li><li> Após o processo de secagem, colocar o HAmodelos revestidos de um cadinho de alumina. Em seguida, colocá-los em um forno de alta temperatura e usar o 8 passo seguinte perfil sinterização. <ol><li> Calor de 2 ° C / min até 230 ° C. </li><li> Calor 1 ° C / min até 280 ° C. </li><li> Aquecer 0,5 ° C / min até 400 ° C. </li><li> Calor 3 ° C / min até 600 ° C. Mantenha a 600 ° C por 1 hora. </li><li> Aquecer 5 ° C / min até 1230 ° C. Manter 1230 ° C durante 3 h. </li><li> Arrefecer 5 ° C / minuto até à temperatura ambiente. Nota: a sinterização irá reduzir ainda mais os modelos de esponja revestidas por HA de cerca de 22% - 25% em cada dimensão. </li></ol></li></ol> 4. Ingress e inhabitancy de células em Template <ol><li> Culturas de células MC3T3 pré-osteoblásticas em um meio não-osteogénica que consiste em α-MEM, suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de antibióticos (estreptomicina e penicilina) a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO 2 . </li><li> Adicionar 10 mlde uma suspensão de células a 2 x 10 6 a densidade celular em uma única bem dentro de uma placa de 6 poços. </li><li> Coloque o molde em forma de ponte de 3 cm x 4 cm x 1 cm verticalmente na placa de 6 poços. Coloque uma perna do modelo na placa que contém a suspensão de células, e a outra perna num poço vazio adjacente. </li><li> Permitir que o molde para absorver a suspensão de células durante 10 min. </li><li> Adicionar 5 ml de meios em seguida para o poço que foi inicialmente cheio com a suspensão de células. </li><li> Reabastecer o meio em ambos os poços cada 2 ou 3 dias até 7 dias se passaram. </li><li> Determinar a eficácia da mobilidade celular por hematoxilina e eosina 11. <ol><li> Fixar as células e andaime por imersão em EtOH a 100% por 20-30 min. </li><li> Mancha com hematoxilina para 1-2 min. </li><li> Enxágüe com água destilada por 1-2 min por duas vezes. </li><li> Desidratar por imersão em 70%, depois 95%, depois 100% de EtOH durante 1-2 min cada. </li><li> Coram com eosina por 20-30 seg. </li><li> Enxágüe com água destilada por 12 min para o dobro. </li><li> Desidratar por imersão em 70%, 80%, 90%, e 100% de EtOH durante 1-2 min cada. </li><li> Incorporar o andaime em uma resina acrílica para seccionamento e de imagem. </li></ol></li><li> Determinar a viabilidade celular, com o ácido 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazólio (MTT) a viabilidade celular e ensaio vivo / morto (células vivas / mortas kit de coloração com MPTP) no tempo de pontos do dia 3 e 7 11. Nota: O esquema de protocolos de fabricação do modelo de osso-como são representados no &quot;Resultados representativos&quot; sessão. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Um molde de multi componente incluindo células, factores de crescimento, nutrientes, etc, é necessária para a regeneração do osso bem sucedida e restauração funcional de grandes defeitos ósseos críticos de tamanho. Dentro desses fatores, propriedades biológicas anatomicamente conformes são essenciais. Para realizar a funcionalidade biológica, o molde deve apresentar biocompatibilidade, osteocondutividade, integridade mecânica, uma superfície, uma textura de superfície adequada, e os meios para o transporte de oxigénio e de nutrientes. Ao nível celular, as seguintes características são especialmente crucial para a restauração funcional de defeitos ósseos maciços: penetração facilitado em modelo (recrutamento activo), a distribuição uniforme em todo o modelo (retenção), a proliferação acelerada e alta viabilidade (habitação). Finalmente, a formação subsequente de matriz extracelular substancial e o desencadeamento de expressão do gene são cruciais em processos biológicos essenciais, tais como uma rápida vascularizaçãoosteogênese nd. Muitos tipos diferentes de substitutos sintéticos têm sido propostos para substituir auto- / alo- enxertos ósseos. No entanto, a organização andaime actual não exibem um microambiente interno contendo micro-canais e nano-poros, e tem, portanto, não activamente facilitar a infiltração celular, distribuição, e inhabitance em profundidade os substitutos sintéticos que são maiores do que 10 mm. Eles não fornecem pistas físicas para abrir caminho para as células de forma eficiente, rápida e uniformemente migrar profundamente o modelo de osso. Em vez disso, o recrutamento de células passiva limitado cria uma populações de células desigualmente distribuídas entre as zonas exteriores e interiores do andaime. Isto não só agrava o desafio inicial das células que atingem o núcleo interno da matriz, mas também impede o fluxo de nutrientes e comunicação celular com a outra extremidade do substituto sintético. Este tipo de resultados de recrutamento e Habitacionais celulares desproporcional na célula death e crescimento incompleto do osso depois de a escora tenha sido implantado no corpo 14,15. Assim, nós introduzimos o conceito de ação capilar como a sugestão físico primário para superar estes obstáculos. Temos absolutamente de engenharia micro-canais na BMT para induzir a ação capilar que serão responsáveis ​​por a força de arrasto principal responsável para recrutar células profundas na BMT. A técnica de revestimento de esponja PU apresenta várias propriedades únicas. Em primeiro lugar, permite uma fácil preparação das estruturas porosas trabecular bem controlados, que se dependem das estruturas do molde pré-definido (ou seja, 80 poros por polegada molde para 300-400 mm). Isto é muito importante para a optimização de tamanho de poro de 15 osteoblastos infiltração. Em segundo lugar, a técnica permite a construção de micro-canais interligados, que representam o papel significativo de inicializar deslocalização da célula 11. Em terceiro lugar, quase não há limitações ao usar a esponja PU em termos de criação de formas e tamanhos dos modelos personalizados. O fabricante pode usar uma tesoura para formas simples ou até mesmo de corte a laser computadorizada para geometrias complexas. Usando essas tecnologias precisamente controladas, criamos o TMO. HA foi seleccionado como o material de partida, devido à sua biocompatibilidade e capacidade osteocondutora 17. Neste estudo, existem vários passos críticos que precisam ser destacados. Durante a preparação das suspensões de HA, se a temperatura for demasiado elevada e a velocidade de agitação é demasiado baixa, a suspensão de HA vai ficar preso na extremidade inferior do recipiente e secar. Após o processo de revestimento, quando se sopra para fora o excesso de pasta fluida HA, demasiado elevada de uma pressão de ar pode induzir fissuras na superfície do TMO. É importante manter a pressão de ar relativamente baixo para expor adequadamente o excesso de pasta fluida HA única. Finalmente, os segundo e terceiro passos do processo de sinterizaçãosão mais crucial (calor 1 ° C / min até 280 ° C e calor de 0,5 ° C / min até 400 ° C). Neste intervalo de temperatura, a esponja PU vai queimar completamente fora enquanto o HA torna-se densa. Se este protocolo não é seguido de perto, o TMO será recolhido ou se desintegrou após a sinterização. O TMO descrito no presente estudo oferece várias vantagens. Em primeiro lugar, as macro-poros interconectados (300-400 um) imitam os de osso trabecular humano e permite o fluxo de medula óssea suave. Em segundo lugar, os moldes são constituídos por micro-canais (25-50 ^ m) em cada septo trabecular para acelerar a entrada inicial de células de osso através da acção capilar. Como demonstrado utilizando simulação computacional 13, se o modelo apenas 300 uM poros primários (poros) e não há microcanais, a acção capilar seriam insuficientes para a saturação completa do molde com medula óssea. Isso seria especialmente verdadeiro para grandes defeitos tamanho que exigiriam lmodelos de tamanho arge. Sized micrômetros de canais exibem absorção de fluidos altamente eficaz e, assim, esperava que os micro-canais a ser a principal responsável pela acção capilar em nosso estudo. Em terceiro lugar, os nossos BMTs foram estrategicamente colocados nano-poros. Dados da literatura indicam que as células são especialmente sensíveis à nano-padrões 18,19; portanto, esperado que os nano-poros nas paredes dos microcanais para desempenhar um papel no aumento da ligação de células. Poros de tamanho nano (100-400 nm) na superfície da septos trabecular permitidos para ancorar células imobilizadas. Em geral, os efeitos combinados destas três estruturas internas resultou na mobilização e adesão celular aumentada ao longo do molde. No entanto, existem algumas limitações do protocolo e os passos críticos para fabricar o BMT perfeito. Por exemplo, há muitas vezes uma grande quantidade de pasta fluida HA preparados, devido à dificuldade de manter uma viscosidade enquanto o revestimento homogéneo. Além disso, há uma limitação na tomadamodelos de mais de 5 cm 3 de volume devido ao tempo de trabalho, enquanto revestimento. A espessura do revestimento é crítico que varia de acordo com as técnicas do fabricante. Os resultados do nosso estudo sugerem que a BMT capaz de absorver e reter as células irão oferecer potenciais vantagens sobre andaimes alloplastic convencional (ou sintético). Um estudo prospectivo, está a ser considerado para verificar os benefícios da BMT na osteogénese e / ou angiogénese, juntamente com os factores de crescimento relacionadas com os ossos. Por isso, afirmamos que o nosso único destaque BMT andaime pode tratar das principais barreiras da infiltração da medula óssea insuficiente para as construções sintéticas e regeneração óssea incompleta em grandes defeitos. O objetivo final deste estudo é o de simplificar o paradigma atual de bioengenharia na reconstrução óssea e restauração funcional em defeitos ósseos de tamanho crítico, eliminando a necessidade de estroma da medula óssea tempo- / trabalho intensivoprocessos de células l de isolamento e expansão. Finalmente, pretendemos utilizar anatomicamente conformando-construções em 3D com micro-canais e nano-poros, que induzem uma rápida absorção celular, distribuição homogênea, e inhabitance para a reconstrução do osso.

The ultimate goal of bone tissue engineering with synthetic constructs is the incorporation of the constructs into the host bone, repopulation of the constructs with host cells, and reconstitution of gas and body fluid exchanges to restore normal bone function. Considerable research has been reported over the last decade in the use of polymeric and ceramic biomaterials for producing scaffolds1,2. However, the ideal material and fabrication technique for optimal bone tissue regeneration has yet to be identified. In addition, there is an overall lack of success in bringing these technologies to the clinic, especially for the reconstruction and restoration of large bone defects. Therefore, restoring critical sized bony defects still remains a clinical challenge1-5. 
Ideally, the scaffolds for bone tissue regeneration should exhibit biocompatibility without causing inflammatory responses or foreign body/toxic reactions, have closely matched mechanical properties when compared to those of native bone, and possess a mechanism to allow diffusion and/or transport of ions and nutrients. Strong bonding with the host bone, dynamic bone growth, vascular ingrowth, and biodegradation of the scaffolds are equally desirable. Although the use of biodegradable polymer scaffolds has exhibited progress in terms of tissue ingrowth, there are controversies over their use for bone regeneration. 
Notwithstanding these extensive efforts, the highly organized structural synthetic constructs still have limited potential in overcoming the obstacle of passive cell penetration. Most of these approaches have resulted in the in vitro tissue ingrowth with cross-sections of less than a few &#181;m to several mm from the external surface, an incomplete integration with host bone, and only partial bone regeneration in vivo6,7. The pioneering cells do not migrate deeply into the constructs because of the lack of an initial force that pulls them inside before cell colonization begins. Consequently, cell colonization strictly occurs at the scaffold periphery, becoming an obstruction from the periphery to the center of the scaffold. Thus, the diffusion of oxygen and nutrients into the inner parts of the templates becomes limited8. Therefore, it is clear that the architecture of the scaffolds (pore size, porosity, interconnectivity, and permeability) that affect the transport and diffusion of substances throughout the scaffolds is critical for achieving well-distributed cell proliferation and differentiation9,10. Although calcium phosphates have been used in the past for scaffold fabrication, different processes and procedures have often resulted in calcium phosphate scaffolds with varying architectures. Thus, the selection of the manufacturing process becomes important in dictating the scaffold architecture needed for successful bone tissue regeneration.
In conclusion, there are still two major shortcomings of bone tissue engineering that need to be addressed: the initial cell recruitment into the template prior to cell attachment and colonization and the quality of substance flow both into and out of the template.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>polyurethan sponge</td>
			<td>Plastifoam</td>
			<td>PU-3215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">167176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyapatite Powder</td>
			<td>Ossgen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl Alcoho</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">341584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxymethyl cellulose sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">360384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium polyacrylate</td>
			<td>Vanderbilt</td>
			<td>DARVAN 821A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2289</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

distinctive capillary action by micro-channels in bone-like templates can enhance recruitment of cells for restoration of large bony defect

Sem, uma população de células florescente activo que é bem distribuído e ancorado de forma estável com o molde inserido, a regeneração óssea excepcional não ocorre. Com os modelos convencionais, ausência de micro-canais internos resulta na ausência de infiltrado celular, distribuição, e inhabitance profundo no interior dos moldes. Assim, um modelo altamente porosa e uniforme interligado-trabecular de ossos como com micro-canais (modelo microambiente biogênicas; BMT) foi desenvolvido para superar estes obstáculos. O romance BMT foi criado por conceitos inovadores (ação capilar) e fabricado com uma técnica de revestimento de esponja-modelo. O TMO é composto por vários componentes estruturais: primário-poros interconectados (300-400 um) que imitam poros em osso trabecular, micro-canais (25-70 um) dentro de cada trabecula e nanoporos (100-400 nm) sobre a superfície para permitir que as células a ancorar. Além disso, o TMO tem sido documentada pelo estudo teste mecânico para ter simILAR propriedades de resistência mecânica às do osso trabecular humano (~ 3,8 MPa) 12. A BMT exibiu alta absorção, retenção e morada de células ao longo dos (¸) modelos em forma de ponte (de altura de 3 cm e 4 cm de comprimento). As células que foram inicialmente semeadas em uma extremidade dos modelos imediatamente mobilizados para a outra extremidade (10 cm de distância) por acção capilar do TMO no meio celular. Após 4 horas, as células homogeneamente ocupava todo o BMT e exibiu comportamento celular normal. A ação capilar representaram a infiltração das células suspensas na mídia e distribuição (migração ativa) durante todo o TMO. Tendo observado estas capacidades do TMO, projectamos BMTs que irá absorver células de medula óssea, factores de crescimento e nutrientes a partir da periferia em condições fisiológicas. A BMT pode resolver as limitações atuais via rápida infiltração, distribuição homogênea e inhabitance de células em grandes, modelos volumétricos para reparar defeitos esqueléticos maciças.

A estrutura geral do TMO exibe um modelo tridimensional original com estruturas internas do osso trabecular semelhante. A BMT contém macro-poros, micro-canais, e nano-poros. Configurações claras de totalmente interligadas macro-poros (tamanho médio de 320 mícrons), micro-canais (diâmetro médio de 50 mm), e nano-poros (tamanho médio de 100 nm) foram verificadas com um microscópio eletrônico de varredura (EVO-40; Zeiss), bem como através de micro-tomografia. A Figura 1 mostra protocolos detalhados passo a passo na criação de um TMO. Através de um controlo preciso dos protocolos de preparação das esponjas de PU para o processo de sinterização (P1 - P7; Figura 1), as características seguintes podem ser obtidos: uma superfície altamente denso e liso após o revestimento de HA e secagem; um precisamente moldada e dimensionada de 3-D do modelo; uma rede trabecular poroso completamente interligada semelhante à do osso trabecular; e micro-canais sagacidadehin cada trabecula que imitam canais intra-ósseos, tais como canais de Havers e canais de Volkmann (Figuras 2 e 3). Além disso, relativamente elevada resistência mecânica (~ 3,8 MPa) semelhante ao do osso trabecular humano foi medido por um teste de resistência à compressão. Altamente histomorfométricas parâmetros semelhantes com os da vértebra lombar humano osso trabecular foram confirmadas por análise de micro-CT 12. Diferentes magnitudes de ação capilar foram demonstrados através de diferentes diâmetros capilares na Figura 4, utilizando simulação computacional. Através destas simulações, projetamos que a BMT exibiria diferentes taxas de absorção dentro das primárias-poros (300-400 um) e micro-canais (25-70 um), com base nos diâmetros. Capilares menores exibiram capacidades de absorção fortes. Esta suposição foi verificada nesta experiência como demonstrado na Figura 5. O TMO exibiu altamente eficazabsorção e retenção de fluido através da acção capilar das estruturas micro-canal; mancha azul de Stevenel foi usado como meio de fluido para controlar facilmente o fluxo (Figura 5). Com base na simulação computacional, o TMO com estas configurações foram observados para absorver e reter suspensões de células de até 8,5 cm de distância total dentro de 10 seg. Devido a uma forte acção capilar induzida por as estruturas internas, a forma manchado atingido a extremidade oposta de um 3 cm (altura) x 4 cm (comprimento) x 1 cm (largura) do modelo em forma de ponte dentro de 1 min e 40 seg. Além disso, a mobilização de células activo e incorporação no TMO foi observado (Figura 6). Subsequentemente, a mobilização de células homogénea e fixação resultou na proliferação aumentada e a formação de matriz numa formação uniformemente distribuída. Além disso, a longa distância (~ 10 cm) migração de células através do TMO foi validada imediatamente após o TMO foi saturado com a suspensão de células. Se<html> EDED células sobreviveram no segmento modelo que foi exposta ao ar e não imersa no meio de cultura. Nesta experiência, o meio de cultura foi fornecido às células por exclusivamente nos poços que tocam apenas as pernas do andaime. A ação capilar exibida pelos microcanais em seguida deixada para meio fresco para alcançar a parte de cima, ponte do andaime. Após 3 dias de cultura, o modelo tornou-se ocupado com células de proliferação rápida. Após 7 dias de cultura, cada trabecula foi envolvido por matrizes extracelulares e incorporado com células 13. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig1.jpg" /> Figura 1. O protocolo de fabricação modelo global semelhante ao osso a partir do pré-tratamento de PU esponja (P1) para o tratamento térmico final (P7). Mantendo o perfil exacto de sinterização após P7 é crucial para alcançar resistência mecânica favorável.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig2.jpg" /> . Figura 2 microscópio estéreo Representante (AmScope; SM-2TZ-M) imagens (x4) de um ppi 80 dimensionada PU esponja (à esquerda), HA revestido e seco BMT (meio), e sinterizados BMT (direita) (Dimensão: 3. cm de altura x 4 cm de comprimento x 1 cm de largura). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig3.jpg" /> Imagens Figura 3. SEM e micro-CT de um modelo biogenic: (A) uma imagem global de um modelo biogênicas, <st<html> rong&gt; (B, C, D) imagens de micro-canais. A fim de destacar micro-canais claros no trabeculado, o modelo foi granulada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig4.jpg" /> . Figura 4. cálculo computacional de acção capilar com diferentes diâmetros de canal dentro do mesmo período de tempo (0,4 ms), enquanto o maior capilar (d = 300 uM: refere-se ao primário de poros) absorvido a forma (azul) com 0,16 mm de altura, o menor capilar (d = 30 mm: refere-se a micro-channel) absorvida a médio até 0,415 mm de altura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> nt &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig5.jpg" /> Figura 5. As imagens mostraram diferenças de capacidades de absorção de acção capilar com base em diferentes tamanhos de poros-primárias e micro-canais (tamanho de poros primária refere-se ao diâmetro médio: 60 ppi ≈ 470 uM, 80 ppi ≈ 320 mícrons, ≈ 100 ppi 200 um). As linhas amarelas representam a acção capilar induzida pela combinação de poros primários e micro-canais. As linhas vermelhas representam a ação capilar induzida principalmente por micro-canais exibidos em cada trabecula. Como mostrado em (F), o modelo 100 ppi induzida a acção capilar mais forte, o que resulta na saturação completa do molde dentro de 39 seg. Os modelos de 80 ppi e 60 ppi foram testados depois. (B) 0 seg, (C) 0,5 s, (D) 1,5 s, (E) 17,0 seg, (F) 39,0 seg, (L) 50,0 seg, e (H) 1 min 18 seg depois da imersão. (Dimensão Template: 1cm x 1 cm x 4 cm de altura cúbico). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig6.jpg" /> Figura 6. A entrada e a imigração de células dos poços semeados (parte I) para os poços não semeadas parte (V) através dos modelos biogénicas induzidas por acção capilar. As células inicialmente semeadas atingido o fim da perna unseeded (Parte V) imediatamente depois saturação completa. Após 3 dias, a confluência das células foi evidente ao longo de todo o modelo. Após 7 dias, a formação da matriz de colagénio espaço-temporal ocorreu dentro das populações de células (H &amp; E de manchas). (Dimensão Molde: 3 cm de altura x 4 cm de comprimento x 1 cm de largura). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig6large.jpg" target="_blank">Por favor cl</a>ick aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels.

Modelos distintivo ação capilar por micro-canais em Osso-como pode aumentar o recrutamento de células para a Restauração da Grande Bony Defeito

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

distinctive-capillary-action-micro-channels-bone-like-templates-can

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K visualizações.  Columbia University. A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels. 

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Bioengenharia

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

A pele completa Defeito Modelo Estudar a vascularização de Biomateriais<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantificação da função global diastólica por análise baseada em Modelagem cinemática de transmitral fluxo através do formalismo de enchimento parametrizada diastólica

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nutrient regulamento, a alimentação contínua de Expansão em grande escala de células de mamíferos em Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

Visualizando a angiogênese por Multiphoton microscopia In Vivo no andaime de 3D-PLGA/nhập geneticamente modificado para raspagem crítico reparo de defeito ósseo

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Detecção visual de vários ácidos nucleicos em uma matriz capilar

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells&#039; Cardiomyogenic Potential

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

Estimulação simultânea de elétrica e mecânica para aumentar o potencial de Cardiomyogenic das células

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...