Esta medida constrói um modelo mínimo da célula desprovida de complexas regulamentações bioquímicas. A técnica utilizada pode gerar alto rendimento de lipossomos e ter alta eficiência de encapsulamento para proteínas citoesqueletos. Essa medida pode ser aplicada ao encapsulamento de variedade de proteínas e objetos grandes, como micropartículas e micro-nadadores auto-preparadores.
Um indivíduo está lutando para aumentar o rendimento lipossomo para as primeiras várias tentativas. Recomenda-se discutir regularmente a seção do manuscrito para obter mais detalhes para aumentar o rendimento. Para começar, prepare o aquoso tampão interno não polimerização em um volume total de cinco mililitros misturando 0,1 mililitro CACL dois, 10 mililitros HEPES, um mililitro DTT, 0,5 mililitro DAPCO, 320 mililimilhas de sacarose e 0,2 mililitro ATP.
Prepare a mistura de proteínas adicionando proteínas ao tampão interno de não polimerização a quatro graus Celsius. Para formar uma camada de actina, adicione 100 gellcalina nanomolar, quatro tosselina micromolar e 2,2 micromolar VCA HEZ à mistura de proteínas. Como um experimento de controle, substitua a mistura de proteínas por 100 microgramas por corante fluorescente mililitro.
Prepare o tampão de polimerização interna aquoso em um volume total de cinco mililitros misturando 100 mililitros de potássio. Quatro cloreto de magnésio milimona, 10 mililitros HEPES, um mililitro DTT, 0,5 mililitro DABCO, 10 milimilas ATP e 80 milimilas de sacarose. Prepare o buffer final misturando tampão interno não polimerização e tampão de polimerização interna em uma razão de volume de um para um, para produzir a solução aquosa interna em um volume total de 30 microliters que serão encapsulados dentro do lipossomo.
Prepare o tampão externo aquoso em um volume total de 150 microliters misturando HEPES de 10 mililitros, 50 milimil de cloreto de potássio, dois cloreto de magnésio milimil, 0,2 milimolar de cloreto de cálcio, dois ATP milimilas, um milimil DTT, 0,5 milimil DAPCO, 212 milimonas de glicose e 0,1 miligramas por casing beta mililitro. Para preparar a mistura de óleo lipíduo, comece adicionando 100 microliters de 25 miligramas por mililitros EGGPC em um frasco de vidro. Evaporar clorofórmio com gás argônio deixando um filme lipídedo sólido seco na parte inferior do frasco.
Para formar uma camada de actina, adicione lipídio de níquel a uma proporção de 10 a uma razão de EGGPC para lipídio de níquel e misture, antes da evaporação do clorofórmio. Adicione dois mililitros de óleo mineral. Evaporar o clorofórmio e sonicar a mistura de óleo lipíduo à temperatura ambiente em um banho por uma hora, para resuspensar os lipídios.
Prepare um tampão final na emulsão do óleo para preparar gotículas lipídicas monocamadas contendo a proteína de interesse. Comece tomando 100 microliters da mistura de óleo lipíduo em um tubo plástico e adicione 10 microliters de tampão final à mistura de óleo lipíduo. Certifique-se de que o buffer final está em uma gota.
Usando uma seringa de vidro, desenhe uma pequena quantidade de mistura de óleo lipídico primeiro e, em seguida, a gota final tampão colocando a ponta da seringa na periferia da gotícula para quebrá-la em pequenas gotículas. Aspire suavemente várias vezes até formar uma emulsão nublada. Coloque 30 microliters de tampão externo em um tubo plástico separado.
Coloque 30 microliters da mistura de óleo lipíduo em cima do tampão externo e deixe descansar por aproximadamente 10 minutos para desenvolver uma monocameira lipídica na interface. Para preparar lipossomos, adicione cuidadosamente 50 microliters da emulsão final do óleo tampão, à fase superior do óleo do tubo. Centrifugar o tubo plástico a 100 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius.
Varie a velocidade de tempo e centrifugação, para otimizar para a formação de lipossomos. Remova cuidadosamente a fase do óleo por pipeta aspirar volume extra, se necessário. Certifique-se de não colocar a ponta da pipeta na lateral do tubo para evitar criar um menisco de óleo em cima da fase liposesome.
Com uma nova pipeta, corte a ponta da pipeta. Coloque lentamente a pipeta na fase inferior restante e aspire o volume aquoso para coletar lipossomos. Despeje 100 microliters de tampão externo no poço de uma câmara de incubação.
Deposite suavemente os lipossomos coletados no tampão externo e, em seguida, coloque outro deslizamento de cobertura em cima da câmara. Observe lipossomos com um microscópio confocal usando um objetivo de imersão de óleo de 63 x. Use linhas laser 488, 647 e 561 nanômetros.
Observar lipídio fluorescentemente rotulado, corante fluorescente encapsulado e atuação fluorescente encapsulada, respectivamente. Capture os quadros de interesse e salve as imagens no formato TIF. Processe e analise imagens na imagem J.Start abrindo o arquivo TIF, usando o software image J.
Vá para a imagem e clique em ajustar. Seguido pelo contraste de brilho, ajuste o brilho e o contraste da imagem na escala desejada, ajustando as configurações mínimas e máximas e os controles deslizantes de brilho e contraste. Clique na ferramenta de seleção de retângulos na barra de ferramentas e selecione a região de interesse.
Vá para a imagem e clique em crop para cortar o ROI. Vá para analisar e clique em escala definida. Na janela pop-up, digite 1.0 no campo de proporção de pixels e coloque o micrômetro como a unidade de comprimento.
Na distância no campo pixels, digite a largura da imagem em pixels. No campo de distância conhecido, digite a largura real da imagem em mícrons. Para medir o tamanho do lipossomo, usando a ferramenta de seleção oval na barra de ferramentas, desenhe um círculo ao longo da borda do lipossomo.
Vá analisar, em seguida, clique na medida, para medir a área do círculo, a partir da qual o diâmetro do lipossomo pode ser calculado. A geração liposasome bem sucedida é verificada através da visualização do fino anel circular que é o bicamadorão lipídeto fluorescente verde. Sob um laser de 488 nanômetros usando microscopia confocal para confirmar o encapsulamento do corante fluorescente.
O ambiente interno dos lipossomos deve ser uniformemente fluorescente sob um laser de 647 nanômetros. A formação de lipossomos poderia ser visualizada pelos finos anéis circulares verdes. O afeto reconstituído nas redes dentro dos lipossomos são heterogêneos, manifestando-se como estruturas de rede ramificadas de filamentos actin.
A arquitetura do ramo foi desencadeada pela introdução do complexo ARP dois três, que controla simultaneamente a nucleação e ramificação de filamentos de actin, juntamente com vca HEZ. Uma fina, mas densamente ramificada camada de actin é criada no folheto interno do bicamado de lipossomos que podem ser visualizados como uma obrigação fluorescente. A mistura final de tampão de áudio lipídudo deve ser geralmente bombeada para frente e para trás através de uma seringa de vidro, para evitar a introdução de bolhas de ar.
A mistura deve ser esbranquiçada após o processo. Essa técnica abriu caminho para a construção de um modelo mínimo da célula, desprovido de complexas regulamentações bioquímicas. Com esta célula imitando o sistema os pesquisadores podem explorar as propriedades mecânicas e dinâmicas das proteínas do citoesqueleto, do nucleador e do motor molecular.
