Este protocolo facilita uma medição confiável das propriedades mecânicas da membrana da vesícula lipídica sintética e real do polímero usando uma técnica de aspiração de micropipette. Esta é a única técnica que permite que a flexibilidade da membrana e a instabilidade sejam esticadas para serem avaliadas em experimentos únicos. Este protocolo envolve uma série de procedimentos desde a preparação da vesícula até a avaliação mecânica.
É muito importante ser paciente e resolver quaisquer problemas técnicos à medida que surgem. A visualização dessas técnicas é fundamental para entender como tratar adequadamente a superfície capilar e como realizar a etapa de pré-estressão obrigatória. Mostrando a vesícula sem defeitos.
O procedimento de demonstração será Martin Fauquignon, um estudante de doutorado do laboratório que trabalha no desenvolvimento de vesículas lipídicas de polímeros híbridos. Antes de iniciar o procedimento coloque os capilares de micropipette de vidro frio verticalmente em suportes. E abaixe os suportes até que as pontas estejam imersas na solução de albumina de soro bovino de glicose recém-preparada durante a noite.
Na manhã seguinte, a solução deve ter subido cerca de um centímetro nas pontas por ação capilar. Utilizando uma seringa de vidro de 500 microliter, equipada com uma capilar de sílica fundida flexível, encha cada pipeta com a solução de glicose. Em seguida, aspire a solução de cada pipeta, antes de reabastecendo as pipetas com solução de glicose fresca várias vezes até que todo o soro como foi removido.
Para preparar uma câmara de eletroformação, primeiro limpe slides ITO com um solvente orgânico apropriado e identifique a superfície condutora com um Ohmeter. Conecte fios elétricos ao lado condutor de cada lâmina com fita adesiva. Mergulhe um capilar em solução ampivial até que cerca de 5 microlitres da solução tenha sido coletado por ação capilar.
Coloque o capilar carregado em contato com o centro de uma placa ITO de vidro e espalhe suavemente a solução pelo slide. Quando o solvente tiver evaporado completamente, aplique a solução mais duas vezes como apenas demonstrado. antes de adicionar uma camada de graxa sem silício em ambos os lados do espaçador aberto do anel O ao redor da área de deposição.
Em seguida, coloque a face condutora de uma segunda placa de vidro ITO na parte superior do espaçador, e coloque a câmara de eletroformação sob vácuo por 3 horas para remover quaisquer traços de solvente orgânico. Para a eletroformação de Vesículas Unilamellar Gigantes, conecte os fios elétricos ao gerador. Defina a frequência do gerador para 10 Hertz, e a amplitude para 2 Volts, pico ao pico.
Quando a tensão for definida, use uma seringa equipada com uma agulha de diâmetro interno de 0,8 milímetros para injetar um mililitro de solução de sacarose molar de 0,1 na câmara e deixar a câmara sob a tensão aplicada e a frequência por 75 minutos. No final da eletroformação, desligue o gerador. E use a seringa de um mililitro para aspirar um pequeno volume de solução até que uma bolha de ar seja produzida dentro da câmara.
Incline a câmara ligeiramente para mover a bolha para dentro da câmara, e para ajudar as vesículas a se desprender da superfície do slide. E aspirar todo o volume de solução na seringa. Em seguida, transfira a solução vesícula para um tubo plástico de um mililitro.
Para configurar os materiais para a micromanipulação, aspire para criar um fluxo de água, um tanque de água pura, para um suporte. E toque levemente enquanto levanta o tanque para eliminar quaisquer bolhas de ar, e para criar pressão positiva. Encha um capilar revestido de soro com solução de glicose fresca até que uma gota se forme na ponta.
Remova a tubulação de seringa do suporte metálico para criar um leve fluxo de água na extremidade do suporte e gire o capilar de cabeça para baixo para conectar a gota de glicose ao fluxo de água. Em seguida, dane-se o capilar e o suporte juntos. Para posicionar a pipeta, cole dois slides de vidro de um estágio de alumínio feito sob medida juntamente com graxa de vácuo.
E instale os slides em um estágio de microscópio. Usando uma pipeta de um mililitro, forme um menisco entre os dois slides com glicose molar 0,1. Coloque a pipeta e seu suporte na unidade motora do micromanipulador.
Aperte o botão de fixação e use o joystick do painel de controle no modo grosseiro. Abaixe a micropipette perto do menisco de glicose. Use o modo fino para ajustar a posição da ponta ao centro do menisco.
Mergulhe a ponta na glicose para limpar suas superfícies externas e internas. Depois de alguns minutos, retire o capilar do menisco e substitua a glicose por um menisco fresco. Aspire dois microliters de Gigantes Unilamellar Vesicles em 0,1 sacarose molar, em uma ponta de micropipette de 20 mililitros.
Introduza as vesículas no menisco. Use o microscópio para observar as vesículas na parte inferior da câmara de slides. Quando as vesículas estiverem ligeiramente deflacionadas, reinserir a pipeta de sucção e focar na ponta da pipeta.
Em seguida, ajuste a altura da linha de base do reservatório de água para a pressão em que o movimento das partículas é interrompido. Cerque o menisco com óleo mineral para evitar a evaporação. Para realizar um experimento de aspiração de micropipette, abaixe a ponta da pipeta no menisco.
Crie uma pequena quantidade de pressão de sucção para aspirar uma vesícula. A membrana da vesícula selecionada deve flutuar ligeiramente e não deve apresentar defeitos visíveis. Use o micromanipulador para elevar a pipeta a um nível mais alto para isolar a vesícula aspirada de outras vesículas.
Abaixe o reservatório de água para aproximadamente 10 centímetros para pré-estressar a vesícula antes de levantar o tanque para retornar a pressão ao valor inicial. A partir de uma altura de 0,5 centímetros, diminua lentamente a pressão de sucção até que uma pressão na qual a membrana flutua seja atingida. Em seguida, aumente a pressão para visualizar claramente uma língua na ponta, o comprimento de projeção de alguns mícrons.
Para determinar o módulo de dobra, aumente a pressão de sucção, um micrômetro de cada vez de forma stepwise. Até que 0,5 a 0,8 milNewtons por metro seja atingido. Esperando cinco segundos, e tirando uma foto da língua após cada passo.
Para determinar o módulo de compressão da área, e a tensão e a tensão de lise continuam a aumentar a pressão de sucção de 0,5 milnewtons por metro até que a tensão de ruptura seja atingida. Neste experimento representativo, o módulo de compressão da área e a cepa de lise para o POPC estavam em perfeita concordância com o esperado da literatura. Nesta tabela podem ser observados valores típicos para os polímeros obtidos.
Note que a dureza da membrana obtida a partir de copolímeros diblock é muito maior do que as obtidas do copolímero tribloco. Curiosamente, usando o copolímero diblock, é possível obter um Gigante Híbrido Unilamilar Lipid Polymer Vesicles que demonstre uma dureza mais robusta do que a medida para lipossomos. Este protocolo pode ser útil para medir vesícula com uma pipeta, por exemplo, para medir a permeabilidade da membrana através de choque asmático.
Certifique-se de completar cada etapa com rigor e precisão, especialmente ao configurar a conexão tribuna. Esta técnica tem sido explorada para compreender a origem física da fissão da membrana, através da medição da tensão da linha nos principais limites em vesículas modificadas.
