Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde concessão # 1R01CA120825-01A1, a Pesquisa Colaborativa Biomédica (CBR) Programa da Universidade de Massachusetts Amherst, e da Bolsa de Isenberg para Bhushan J. Toley. Agradecemos a valiosa contribuição de Tiago Schafer, o cinegrafista, narrador e editor deste vídeo.

1. Fabricação de dispositivos Replicação de características microfluídicos em materiais elastoméricos baseou-se no método descrito por Duffy et al. 1 <ol><li> Elastómero Mix (polidimetilsiloxano; PDMS) e agente de cura a partir do kit de elastómero de silicone (Dow Corning, Midland, MI) numa proporção em peso 9:1 e derramar sobre o mestre para formar uma camada de 4 mm de espessura. Degas para remover as bolhas de ar e cura a mistura a 60 ° C durante 5 horas. Peel curado PDMS do molde para se obter um selo de características de fluxo do elastómero. </li><li> Faça furos para entradas e saídas através de um 1,5 milímetros biópsia com punch (Miltex, York, PA) montado em uma furadeira. Retire todos os restos. </li><li> Submeta o lado características do carimbo e uma lâmina de vidro limpa para plasma de oxigênio por 8 minutos em um etcher plasma de oxigênio. Trazer as superfícies tratadas imediatamente em contacto para formar uma ligação entre eles. Manter o conjunto a 60 ° C em um aquecedor de corrediça, pelo menos, 5 horass para fortalecer o vínculo. </li><li> Ligue 0,032 &quot;ID tubagem de PTFE (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) para as entradas e saídas que utilizam uma interface de luer lock macho ligado a conectores luer lock fêmea farpado conectores (Qosina, Edgewood, NY). </li><li> Defina-se a montagem de fluxo, utilizando válvulas desligado e um Y-conector (Upchurch Científica, Oak Harbor, WA; Figura 1). Montar o dispositivo para o microscópio. Anexar seringas para tubulação usando 20G 1,5 &quot;agulhas (BD Bioscience, Rockville, MD). </li></ol> 2. Formação de esferóides uniformes Esferóides foram formados pelo método de gota suspensa 2,3. <ol><li> Tripsinizar células sob um capuz estéreis de cultura de células. </li><li> Centrifugar as células tripsinizadas a 2000 rpm durante 5 minutos e ressuspender em 6 ml de meio fresco. Dilui-se a solução-mãe a uma concentração final desejada (Tabela 1). </li><li> Retire a tampa de uma placa de 48 poços e colocá-lo de cabeça para baixo no sterilized capô. Regiões circulares correspondentes a cada poço são aparentes na tampa. Encher cada poço da placa com 1 ml de água esterilizada para manter a humidade. Colocar uma gota de 20 ul da solução diluída de células em cada região circular utilizando uma micropipeta. Inverter cuidadosamente a tampa e colocá-lo sobre a placa assim, assegurar que as gotas não tocar as bordas das cavidades. </li><li> Incubar a placa de poço a 37 ° C durante um número especificado de dias (Tabela 1). Um esferóide vai formar em cada gota em suspensão. </li></ol> 3. Introdução de esferóides no dispositivo Consultar a Figura 1 e na Tabela 2 para esta secção. <ol><li> Esteriliza-se o dispositivo, através de lavagem com etanol a 70% introduzido através da entrada do fluxo. Posteriormente, lavar com PBS seguido de tampão HEPES meio de cultura celular. Deixar a seringa médio F S ligado ao tubo. </li><li> Desenhar 2-3 esferóides em P seringa S, toque seringa para remover as bolhas de ar, eanexar à entrada do dispositivo de embalagem. </li><li> Abrir válvula de entrada V Pin e Fin V perto. Abrir a válvula de saída Pout V e V Fout perto. Segurar a seringa de embalagem vertical com a agulha a apontar para baixo; observar como esferóides se depositam no fundo da seringa para dentro do conector luer lock da agulha. Empurrar o êmbolo da seringa de embalagem e esferóides relógio entrar no tubo e fluir para dentro do dispositivo. Uma vez que apenas a válvula de saída da embalagem é aberta, um esferóide vai entrar na câmara do dispositivo e ser retido por mensagens na parte de trás (Fig. 2). </li><li> Fechar válvula de entrada V Pin e saída da válvula Pout V. F montar a seringa S sobre uma bomba de seringa. Abrir a válvula V Fin e válvula V Fout. Meio de fluxo para o dispositivo de 3 ul / min. </li></ol> 4. Introdução do agente de detecção de apoptose (CaspGLOW) Após a embalagem câmaras com esferóides, para permitir o equilíbrio up a 24 horas para estabelecer gradientes de nutrientes e microambientes, antes de introduzir a apoptose ou a detecção de agentes terapêuticos. Uma vez que os tecidos em câmaras estão em contacto com as paredes impenetráveis ​​de topo e de fundo, não existem gradientes de nutrientes ao longo da espessura (0,15 mm) do tecido. Após 24 horas de incubação, todas as camadas de células ao longo da espessura do tecido é, portanto, equivalente a heterogeneidade e é apenas numa direcção para longe do canal de fluxo. <ol><li> Desligue V Fin, parar a bomba de seringa, remover a seringa S F a partir da bomba e substituí-la por uma seringa com meio contendo 0,25 ul / ml de Red CaspGLOW activa da caspase-3 marcador (Red-DEVD-FMK; Biovision, Mountain View, CA). </li><li> Manualmente lave de 0,7 ml desta solução por meio do dispositivo para assegurar o deslocamento do meio velho. Montar a seringa sobre a bomba, reiniciar o fluxo, e aberto Fin V. Ao longo de um período de 5-8 horas, a apoptose detecção difunde agente em tele tecido e fluoresce em regiões mais brilhantes apoptóticas. Agente apoptose detectar a esta concentração é mantida em todas as soluções de fluxo posteriores para dentro do dispositivo. </li></ol> Nota: <ol class="lroman"><li> Heterogeneidade do tecido pode ser confirmada através da obtenção de perfis de intensidade de fluorescência linear como descrito na Secção 6. Os perfis devem mostrar gradientes espaciais na apoptose, o que confirma que o tecido é heterogénea em relação à viabilidade celular. </li><li> CaspGLOW Verde Activo marcador Caspase-3 (Fluoresceína-DEVD-FMK; Biovision) também pode ser usado para detectar a apoptose. Este marcador contém o fluoróforo verde fluoresceína em vez do fluoróforo vermelho rodamina. </li></ol> 5. Introdução do agente terapêutico <ol><li> Seguir o procedimento em passos 4,1-4,2 para introduzir 10 mM de cloridrato de doxorrubicina (Dox, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) contendo agente de detecção de apoptose. </li><li> Continuar o fluxo do therapesolução agente UTIC por um período fixo de tempo. Válvula de corte Fin V e desligar a bomba de seringa. Substituir o tratamento com uma seringa seringa meio fresco contendo a apoptose detecção do agente. Permitir o fluxo de meio fresco durante 24 -36 horas, enquanto monitorando continuamente o tecido sob um microscópio. </li></ol> 6. Time-lapse Microscopia e Estimativa dos coeficientes de difusividade de drogas Para a obtenção de dados de fluorescência mais limpas, adquirir todas as imagens, concentrando-se o microscópio sobre as camadas inferiores de tecidos. Como não existem gradientes de nutrientes na direção vertical (ver Seção 4), as camadas inferiores de células são bons representantes de todas as outras camadas acima. <ol><li> O processo de aquisição de toda foi automatizado através de um script personalizado em IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Adquirir imagens de luz transmitida e fluorescência do esferóide embalado com uma ampliação de 10x a cada 30 minutos (Fig. 3A). Acquire uma imagem da fluorescência de fundo antes da introdução de Dox. Para acomodar o grande tamanho da câmara (1000 um x 300 mm), adquirem duas imagens adjacentes e telha los juntos 4. </li><li> Para a estimativa dos coeficientes de difusividade matemático de drogas, o primeiro passo é o de gerar perfis de intensidade médias lineares de fluorescência usando ImageJ Dox. Seleccionar uma região rectangular de interesse (ROI) que engloba o tecido dentro da câmara. Usar o comando Perfil Plot para gerar um perfil de intensidade média como uma função da distância a partir do canal de fluxo. Repita o procedimento para até 3 pontos de tempo diferentes. </li><li> Obter uma imagem de fundo de fluorescência antes da introdução Dox para medir a autofluorescência do tecido. Subtraia a média da intensidade de fluorescência de fundo a partir dos perfis de intensidade obtidos e normalizar cada perfil com a intensidade máxima correspondente para obter <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="c" /> (X, t) (fig. 3B). </li><li> O próximo passo é avaliar o coeficiente de difusão eficaz da D Dox no tecido do tumor. Dox difusão pode ser representada pela seguinte equação 5 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="Equação 1"/> onde erfc é a função de erro complementar, x é a distância para o tecido a partir do canal, e t é o tempo após a introdução de Dox (consulte a fig. 3). Use o seguinte esquema iterativo em cada ponto de tempo considerado: <ul><li> Acho um valor para D </li><li> Calcule lado direito da equação em cada posição x </li><li> Calcular a soma dos erros quadráticos (residual) entre os dois lados </li><li> Modificar D para minimizar o resíduo </li></ul></li><li> Calcular a média dos valores óptimos de D obtidos em cada ponto temporal para estimar o coeficiente de difusão médio eficaz de Dox no tecido. </li></ol> 7. Resultados representativos: &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Os dispositivos microfluídicos desde 1mm x 0,3 milímetros x 0,15 milímetros opticamente câmaras cultura acessível para o crescimento de tridimensional do tecido tumoral. Esferóides tumorais multicelulares foram levados para estas câmaras e foram mantidas por dois postes de filtro na parte de trás. O método de gota pendente permitiu rápida formação de esferóides de tamanho consistente e forma a partir de várias linhas celulares. Esferóides foram cultivadas com sucesso no dispositivo por até 3 dias. Crescimento nas câmaras foi associada com uma alteração reprodutível da microambientes dentro esferóides. A apoptose nas células ocorreu menos na proximidade do canal de fluxo e mais elevado para os tecidos. O dispositivo foi utilizado para estimar o coeficiente de difusão da doxorrubicina em tecido tumoral. O valor obtido de 8,75 x 10 -7 cm 2 s -1 concorda com o valor de 9,1 x 10 -7 cm 2 s -1 relatado anteriormente 6 em cancro da mama humano. <table border="1"><tbody><tr><td> Linha Celular </td><td> Concentração celular necessária </td><td> Tempo de Incubação </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300 células / microlitro </td><td> 2-3 dias </td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750 células / microlitro </td><td> 3-4 dias </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150 células / microlitro </td><td> 5-6 dias </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Parâmetros para Spheroids gota suspensa <table border="1"><tbody><tr><td> Parte </td><td> Descrição </td></tr><tr><td> S F </td><td> Seringa fluxo </td></tr><tr><td> S P </td><td> Embalagem Seringa </td></tr><tr><td> V Fin </td><td> Válvula de admissão de fluxo </td></tr><tr><td> V Pin </td><td> Vedação da válvula de admissão </td></tr><tr><td> V Fout </td><td> Válvula de saída de fluxo </td></tr><tr><td> Pout V </td><td> Embalagem válvula de saída </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Seringas e Válvulas em Configuração de Fluxo <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Esquema do fluxo de configuração V Fin e Fout V:. Entrada de fluxo e válvulas de saída, sendo o pino V e V Pout: entrada de Embalagens e válvulas de saída; F S e S P: Fluxo e seringas de embalagem. A seringa de embalagem e acondicionamento de entrada e válvulas de saída são usados ​​quando um esferóide é levado para dentro da câmara. A seringa e de fluxo de entrada e válvulas de saída de fluxo são utilizados para fluir médio subsequentemente. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="Figura 2" /> A Figura 2. Esquema de um esferóide preso em uma câmara no dispositivo. Um esferóide é vertido para dentro da câmara do dispositivo e é bloqueado por dois pos filtrots na parte de trás da câmara. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Doxorrubicina difusão em tecido tumoral no dispositivo. A. Fusão imagem transmitida e luz fluorescente vermelha de tecido, indicando a localização e a concentração de doxorubicina (a vermelho). Barra de escala representa 250 ^ m. B. perfil de intensidade de fluorescência linear Normalized doxorrubicina.

<ol>
	<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly(dimethylsiloxane).">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li><li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro.">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li><li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics.">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li><li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer.">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li><li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma:+branching+patterns+and+vessel+dimensions.">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li><li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+physiology+of+solid+tumors:+opportunities+(and+problems)+for+cancer+therapy.">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li><li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy.">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A vasculatura em tumores é escassa e mal desenvolvidos 7,8. Existem regiões localizadas longe (&gt; 100 um) a partir de vasos sanguíneos que são inacessíveis aos nutrientes e medicamentos fornecidos embora o 9 vasculatura. O microambiente heterogénea resultante contribui para a eficácia limitada de muitos agentes quimioterapêuticos 10. O dispositivo micro desenvolvido aqui recria um microambiente do tumor heterogéneo caracterizado por proliferação, as células quiescentes e ap...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Kit de elastômero de silicone </td><td> Adhesives Ellsworth </td><td> 184 Sil Elast Kit </td><td></td></tr><tr><td> Miltex biópsia com punch </td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31AA </td><td> 1,5 milímetros </td></tr><tr><td> Tubo de PTFE </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06417-31 </td><td> 0,032 ID &quot; </td></tr><tr><td> Luer lock macho conector </td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td> Conector fêmea luer bloqueio farpado </td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td> Válvula de bloqueio </td><td> Idex Saúde e Ciência </td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Y-conector </td><td> Idex Saúde e Ciência </td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1,5 &quot;agulhas </td><td> BD Bioscience </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Fluoresceína </td><td> Biovision </td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Vermelho </td><td> Biovision </td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de doxorrubicina </td><td> Sigma </td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td> Cólon humano linha de células de carcinoma </td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td> Linha celular humana Carcinoma Ductal </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td> Linha de células de adenocarcinoma mamário humano </td></tr></tbody></table>

microfluidic device for recreating a tumor microenvironment in vitro

Desenvolvemos um dispositivo de microfluidos, que imita a entrega e depuração sistémica da droga a heterogéneos tridimensionais tecidos tumorais in vitro. Nutrientes fornecidos pela vasculatura não cheguem a todas as partes de tumores, dando origem a microambientes heterogéneos constituídos por tipos de células viáveis, quiescentes e necróticas. Muitos medicamentos contra o câncer não conseguem penetrar eficazmente e tratar todos os tipos de células por causa dessa heterogeneidade. As monocamadas de células cancerosas não imitam esta heterogeneidade, tornando-o difícil de testar drogas de cancro com um modelo in vitro apropriado. Nossos dispositivos microfluídicos foram fabricados fora do PDMS utilizando litografia macia. Esferóides multicelulares de tumores, formadas pelo método de gota suspensa, foram inseridos e constrangidos em câmaras rectangulares sobre o dispositivo e mantida com perfusão contínua meio de um dos lados. A forma rectangular das câmaras do dispositivo criado gradientes lineares dentro do tecido. Manchas fluorescentes foram utilizados para quantificar thvariabilidade e na apoptose dentro do tecido. Tumores do dispositivo foram tratados com a droga quimioterapêutica fluorescente doxorrubicina, microscopia de lapso de tempo foi usado para controlar a sua difusão para o tecido, e o coeficiente de difusão eficaz foi estimada. O método de gota pendente permitiu rápida formação de esferóides uniformes de várias linhas de células cancerosas. O dispositivo activado crescimento de esferóides por até 3 dias. As células na proximidade do fluxo médio foram minimamente apoptótica e aqueles longe do canal foram mais apoptótica, o que precisamente imitando regiões em tumores adjacentes a vasos sanguíneos. O valor estimado do coeficiente de difusão doxorrubicina concordou com um valor previamente relatada em câncer de mama humano. Porque a penetração e retenção de drogas em tumores sólidos afecta a sua eficácia, acreditamos que este dispositivo é uma importante ferramenta na compreensão do comportamento de drogas, e desenvolvimento de terapias do cancro novos.

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Nós apresentamos o procedimento para a fabricação e operação de um dispositivo micro que recria heterogêneos microambientes tumorais<em&gt; In vitro</em&gt;. A variabilidade na apoptose dentro do tecido do tumor foi quantificada usando manchas fluorescentes e do coeficiente de difusão eficaz da doxorrubicina droga quimioterapêutica para o tecido do tumor foi avaliada.

Dispositivo microfluídicos para Recriando um microambiente do tumor<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

microfluidic-device-for-recreating-a-tumor-microenvironment-in-vitro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

11.5K visualizações.  University Of Massachusetts Amherst. Nós apresentamos o procedimento para a fabricação e operação de um dispositivo micro que recria heterogêneos microambientes tumorais In vitro. A variabilidade na apoptose dentro do tecido do tumor foi quantificada usando manchas fluorescentes e do coeficiente de difusão eficaz da doxorrubicina droga quimioterapêutica para o tecido do tumor foi avaliada.

Vídeo: Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Um dispositivo micro para o Estudo múltiplas linhagens distintas

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Bioengenharia

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

Análise sistemática de<em&gt; In Vitro</em&gt; Célula de rolamento usando um sistema microfluídicos Multi-bem placa

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Engenharia de Tecidos de tumor estromal Microenvironment com Aplicação a invasão Cancer Cell

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protocolo para a formação de biofilme Streamer em um dispositivo micro com micro-pilares

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

A utilização de uma alta taxa de transferência<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analisando falta de homogeneidade de mistura em um dispositivo micro, pela técnica Microscale Schlieren

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Totalmente dispositivo automático centrífugo microfluídicos para a detecção de proteínas Ultrasensitive de Sangue Total

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Dispositivo microfluídicos para Recriando um microambiente do tumor

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