Este método de co-cultura Transwell é usado para estudar sinalização paracrina usada por células tumorais para suprimir a resposta imune. Este método pode ser usado para descobrir novos ligantes secretados, bem como os fundamentos mecanicistas de seus efeitos supressivos imunológicos. Já usamos esse método para mostrar como fatores secretados pelo tumor podem amortecer a transcrição genética pró-inflamatória do macrófago.
Acreditamos que esta ferramenta tem amplas implicações no estudo da supressão imunológica derivada do tumor. Uma das principais vantagens dessa técnica é que ela pode ser usada para estudar a sinalização paracrina entre células tumorais e células imunes sem a variável potencialmente confusa do contato célula-celular. Esta plataforma também é favorável a uma variedade de técnicas biológicas moleculares para análise a jusante.
Após a colheita de macrófagos peritoneais, emplaque-os diretamente nas câmaras superiores de uma membrana de poliéster de 0,4 micrômetros insira co-cultura de seis poços. Em seguida, adicionou DMEM suplementado ao poço de tal forma que a câmara superior contém um mililitro e a câmara inferior contém 1,5 mililitros. Incubar por três dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Em primeiro lugar, a cultura comercialmente disponível células tumorais em seu respectivo meio, seguindo os métodos recomendados pela ATCC de cultura tecidual. Em seguida, lave as células tumorais aderentes uma vez com PBS. Adicione 0,05% de trippsina em EDTA e incubar a 37 graus Celsius até que as células se desprendem.
Em seguida, suspenda novamente as células em mídia contendo FBS. Use um hemótmetro ou contador celular para quantificar o número total de células e centrífugas a 220 vezes G durante cinco minutos para a pelota. Durante a centrifugação, aspire o meio das câmaras superior e inferior do macrófago contendo placas de suporte de membrana permeável e substitua por meio fresco.
Para as câmaras inferiores onde as células tumorais serão banhadas, preencha com um mililitro de médio em vez de 1,5 mililitros para deixar volume suficiente para adição celular. Quando a centrifugação estiver completa, aspire o meio das células tumorais pelleted e suspenda as células em DMEM suplementado a uma concentração de 300.000 células por mililitro. Adicione 0,5 mililitros desta suspensão celular à câmara inferior dos poços desejados.
Para induzir a expressão genética pro-inflamatória macrófago, trate macrófagos singly ou co-cultivados adicionando gamma interferon em uma concentração de 100 nanogramas por mililitro e LPS a uma concentração de 50 nanogramas por mililitro. Varie a duração dos tempos de tratamento na cultura conforme necessário. A ativação do macrófago ocorre dentro de duas horas, e alguma supressão mediada por tumores ocorre em oito horas.
A co-cultura por 24 horas produz supressão robusta e consistente derivada do tumor. Como um controle negativo, macrófagos culturais cantam e saem sem tratamento. Como um controle positivo, trate macrófagos singly-cultivados com interferon gama e LPS nas mesmas concentrações utilizadas para as amostras.
Após o tempo de incubação desejado ter transcorrido, isole o meio de cultura de lise celular ou condição conforme desejado, dependendo das necessidades de teste. Para isolar o lisecelular para análise quantitativa da reação em cadeia de polimerase, aspire o meio de ambas as câmaras do poço e lave uma vez com dois mililitros de PBS. Aplique tampão de RNA lysis na câmara superior contendo os macrófagos.
Depois disso, raspe suavemente a membrana para liberar o lisete celular e transfira-a para um tubo de coleta para processamento posterior de acordo com o protocolo do fabricante do kit de isolamento RNA. O método de cocultura descrito aqui envolve a cultura de macrófagos e células tumorais sem contato físico. Macrófagos peritoneais cultivados na ausência de células tumorais são usados como controles negativos e positivos.
Macrófagos peritoneais co-cultivados na presença de células tumorais B16F10, mas sem estímulos ativados, não aumentam a expressão de genes associados pró-inflamatórios. Isso implica que os ligantes secretados por tumores ou não são suficientes para induzir a expressão genética pró-inflamatória por si só, ou se houver ativação imune por secreções tumorais, ligantes paracrinos são suficientes para suprimi-lo aos seus níveis nativos. Este método de cocultura ilustra que quando macrófagos polarizados por interferon gama e LPS são cultivados na presença de células tumorais, a supressão da expressão genética associada à inflamação foi reduzida em até 60% Um nível comparável de supressão genética pro-inflamatória do macrófago é observado quando a linha de células macrófagos de murina J774 é substituída por macrófagos peritoneais.
Trabalhos anteriores identificaram a proteína S como um fator secreto pelo tumor que pode inibir a ativação do macrófago, de modo que o modelo de co-cultura de suporte de membrana permeável é usado em conjunto com um lysA para avaliar a concentração de proteína S em mídia condicionada após 24 horas. Em mídia condicionada de células de melanoma B16F10 tratadas com interferon e LPS, a proteína S é expressa em uma concentração de aproximadamente 475 nanogramas por mililitro. Macrófagos peritoneais tratados nas mesmas condições expressavam proteína S a aproximadamente 61 nanogramas por mililitro.
Curiosamente, quando co-cultivada, a concentração de proteína S na gama interferon e no poço tratado por LPS foi de aproximadamente 86 nanogramas por mililitro. Isso sugere que os macrófagos ingerem proteína s secretada por tumor ou que a quantidade de proteína S secretada pelas células B16F10 é substancialmente diminuída quando na presença de macrófagos. Esses resultados destacam mudanças profundas da ativação do macrófago e da sinalização paracrina quando os macrófagos são co-cultivados com células tumorais.
O método de co-cultura transwell pode responder a uma variedade de perguntas relativas à sinalização paracrina. A análise de manchas ocidentais poderia ser conduzida para determinar como proteínas secretadas por tumores alteram várias vias de sinalização em macrófagos.
