Este protocolo descreve como induzir autofagia no corpo adiposo de larvas de Drosophila melanogaster via depleção de aminoácidos e como analisar as diferenças na autofagia entre clones mutantes. Como a autofagia é altamente sensível à disponibilidade de nutrição em condições de cultura, a análise clonal, um método que analisa células mutantes versus células selvagens no mesmo tecido, tem uma vantagem em dissecar defeitos de autofagia. Comece introduzindo três machos e 15 fêmeas de moscas adultas em um frasco de cultura com fubá padrão ou melaço ou ágar Drosophila media a 25 graus Celsius para acasalamento.
Às 48 horas após a indução, toque no frasco para injetáveis de acasalamento até que as moscas fiquem atordoadas e caiam no meio na base do frasco. Desligue o frasco para injetáveis de acasalamento e cubra a boca com um frasco para injetáveis de cultura invertida sem plugue com meios frescos. Em seguida, vire e toque nos frascos para injetáveis para transferir as moscas para o frasco de cultura fresco.
Ligue o frasco para injetáveis de cultura fresca e elimine o frasco para injetáveis velho. Coloque o frasco para injetáveis de cultura fresca numa incubadora de 25 graus Celsius para a postura de ovos no meio fresco. Retire as moscas após seis horas da postura dos ovos e elimine as moscas despejando-as num frasco contendo etanol a 75%.
Incubar o frasco para injetáveis com embriões num banho-maria de 37 graus Celsius durante uma hora para induzir a expressão de flippase. Posteriormente, coloque-os em uma incubadora de 25 graus Celsius e permita que os embriões continuem a se desenvolver. Usando uma espátula de laboratório, retire o meio contendo as larvas em desenvolvimento em uma placa de Petri 75 horas após a postura dos ovos.
Adicione 1X PBS ao prato e separe delicadamente o meio de cultura e as larvas usando pinças longas. Em seguida, selecione 10 a 15 larvas iniciais de terceiro ínstar. Encha os poços de uma placa de ponto de depressão de vidro de nove poços com 1X PBS e coloque as larvas separadas do terceiro ínstar nos poços usando pinças longas.
Lave bem as larvas para remover todos os resíduos do meio. Tome cinco mililitros de solução de sacarose a 20% num frasco para injetáveis vazio e coloque as larvas limpas de terceiro ínstar nesta solução utilizando pinças longas. Incubar este frasco para injetáveis numa incubadora de 25 graus Celsius durante seis horas antes de os colher para dissecção.
Adicione 1X PBS em cada poço da placa de ponto de depressão de vidro de nove poços e transfira as larvas para os poços com pinças longas. Coloque uma larva em um poço com o lado dorsal voltado para cima. Segure a cutícula da larva com duas pinças de 5 no meio do tronco da larva e rasgue suavemente as cutículas.
Os corpos gordurosos expostos, juntamente com outros tecidos internos da larva, ainda estarão aderidos à carcaça da larva. Puxe o suficiente para expor os órgãos internos tanto quanto possível. Repita este passo para todas as larvas.
Transfira a carcaça da larva para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de PFA a 4% e incube por 30 minutos a 25 graus Celsius sem agitar os tubos. Após 30 minutos, pipetar a solução de PFA. Adicione 500 microlitros de 1X PBS no tubo.
Agite suavemente o tubo num rotador plano durante 10 minutos e, em seguida, elimine a solução de PBS 1X. Repita isso três vezes. Usando pinças longas, transfira a carcaça da larva fixa e lavada para um poço na placa de nove pontos de depressão preenchida com PBS 1X.
Retire todos os tecidos corporais não gordurosos com 5 pinças. Finalmente, monte os pedaços do corpo gorduroso em uma lâmina de microscópio usando 80% de glicerol como meio de montagem e coloque uma lamínula por cima. O mutante um e o mutante dois são dois mutantes letais independentes no cromossomo X e as moscas FRT 19A brancas amarelas isogenizadas servem como controle aqui.
Os padrões de GFP-Atg8a foram analisados nos corpos gordurosos de larvas de larvas controle, mutante um ou mutante dois, e os clones mutantes ou controle foram marcados negativamente por RFP. Nos clones controle, os padrões de GFP-Atg8a Puncta foram semelhantes aos das células RFP positivas circundantes. Nos clones mutantes de um mutante, os GFP-Atg8a Puncta foram bastante reduzidos.
E em dois clones mutantes, o número e o tamanho de GFP-Atg8a Puncta foram aumentados. O estágio de desenvolvimento das larvas é crítico aqui. O tempo de desenvolvimento e a duração da fome precisam ser modificados de acordo com as receitas do meio de cultura de cada laboratório.
Este procedimento pode ser aplicado para explorar a autofagia seletiva. Por exemplo, a mitofagia pode ser monitorada em corpos gordurosos de moscas anexando uma proteína fluorescente a uma sequência de alvos mitocondriais.
