Um método laboratorial objetivo aqui apresentado pode ajudar a estudar a reação de hipersensibilidade de contato em camundongos, que mimetiza a dermatite alérgica de contato em humanos. A reação de hipersensibilidade de contato pode ser medida não só pelo edema de orelha, mas também por diversos exames laboratoriais que permitem o estudo dos mecanismos celulares envolvidos nessa reação. O modelo de hipersensibilidade mais em contato pode testar vários fatores ambientais e novas substâncias para mostrar se os fatores testados modulam as respostas imunes dependentes de células T, que podem ser usadas para implementar novas terapias.
Comece raspando a pele do rato com uma lâmina de barbear e rotulando a pata. Seis horas antes da indução da hipersensibilidade de contato, ou CHS, aplicar sabão cinza com água e raspar uma área de dois centímetros quadrados no tórax e abdômen do camundongo. No mesmo dia, sensibilizar os camundongos aplicando 150 microlitros de hapteno 5% recém-preparado no local previamente raspado.
No mouse de controle, aplique apenas o veículo. Secar o ponto de hapteno por 30 segundos antes de colocar o animal de volta na gaiola. No quarto dia, medir a espessura da orelha de um camundongo anestesiado usando um micrômetro a zero hora por um observador que desconhece os grupos experimentais.
Em seguida, aplicar 10 microlitros de hapteno 04% recém-preparado em ambos os lados das orelhas nos grupos teste e controle e deixar secar por 30 segundos. No quinto dia, 24 horas após a aplicação anterior de 0,4%hapteno, repetir a medida da espessura da orelha para a medida de 24 horas. 24 horas após a medição da espessura da orelha, quando o camundongo ainda estiver sob anestesia profunda, corte as orelhas o mais próximo possível do crânio com tesoura.
No lado distal das orelhas, faça um punch de seis milímetros de diâmetro usando um punch de biópsia. Medir o peso de cada biópsia auricular na balança analítica e expressá-lo em miligramas. Para o ensaio de mieloperoxidase, ou MPO, colocar as biópsias auriculares em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros com esferas de aço inoxidável e adicionar 500 microlitros do tampão preparado.
Homogeneizar as biópsias por 10 minutos em um homogeneizador e, em seguida, resfriar a amostra por 15 minutos a 4 graus Celsius antes de homogeneizá-la novamente por 10 minutos. Retire as contas assim que as biópsias forem homogeneizadas. Congele os homogeneizados a menos 20 graus Celsius por 30 minutos.
Descongelar e vórtice as amostras e repetir o procedimento de homogeneização e congelamento três vezes. Uma vez feito, centrifugar o homogeneizado a 3.000 G por 30 minutos a 4 graus Celsius. Colher o sobrenadante com uma pipeta para medir a atividade da MPO e expressá-la em unidades por miligrama de proteína.
Para realizar um teste de permeabilidade vascular, sensibilizar camundongos no dia zero e, no quarto dia, desafiar diretamente aplicando hapteno nas orelhas usando o procedimento mencionado anteriormente. 23 horas depois, injetar por via intravenosa 8,3 microlitros por grama de peso corporal de corante azul de Evans a 1% no soro fisiológico tamponada com fosfato de Dulbecco, ou DPBS, no camundongo anestesiado. Após uma hora, novamente anestesiar o camundongo para coletar as biópsias auriculares, conforme descrito anteriormente.
Para extrair o corante do tecido, incube as biópsias nos tubos contendo um mililitro de formamida a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono por 18 horas. Após a coleta de biópsias auriculares, quando o camundongo ainda estiver sob anestesia profunda, remova o globo ocular com uma pinça. Coloque uma pressão suave no rato e recolha sangue do seio retro-orbital para o tubo para a recolha de soro.
Inverter o tubo seis vezes e esperar 30 minutos para que o sangue coagule. Em seguida, centrifugar o tubo a 1.300 a 2.000 G por 10 minutos à temperatura ambiente. Sensibilizar os camundongos doadores com hapteno TNCB no dia zero usando o procedimento mencionado anteriormente No quarto dia, após desinfetar a pele, isolar os linfonodos axilares e inguinais, ou ALNs, do camundongo anestesiado usando pinças, seguido de isolamento do baço.
Amasse o tecido entre as extremidades foscas de duas lâminas de microscópio e passe a suspensão celular através de um filtro de células com um tamanho de poro de 70 micrômetros. Em seguida, lavar as células com DPBS suplementado com 1% de soro fetal bovino e centrifuga-las a 300 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Decantar o sobrenadante e ressuspender o restante da pastilha celular em um a cinco mililitros de DPBS.
Preparar uma mistura 1:1 de ALNs e baços para atingir uma concentração de até 7,0 vezes 10 para a sétima células em 200 microlitros de DBPS antes de injetar por via intravenosa a mistura de células efetoras de CHS em um camundongo anestesiado. Medir a espessura da orelha em zero hora e após 24 horas do desafio. Os dados mostraram que camundongos sensibilizados ao TNCB e desafiados nas orelhas quatro dias depois desenvolveram aumento significativo do inchaço da orelha, em comparação com camundongos controle sensibilizados por simulação e, em seguida, desafiados similarmente.
O aumento do edema de orelha no grupo teste resultou em aumento do peso da orelha, da atividade da MPO, da concentração de interferon gama nos extratos da orelha, das alterações da derme edematosa no exame histológico e da permeabilidade vascular da orelha Os anticorpos IgG1 específicos para TNP estavam elevados no soro dos camundongos teste quando comparados com os animais controle. Os animais que receberam as células efetoras CHS de doadores previamente sensibilizados com TNCB apresentaram aumento significativo do edema da orelha, comparados aos animais que não receberam as células. O momento mais crítico é desencadear a hipersensibilidade de contato.
A solução de hapteno é muito volátil e sensível à luz, por isso deve ser rapidamente aplicada na pele dos animais. Testes adicionais podem ser realizados nas células efetoras isoladas. Por exemplo, culturas de células podem ser estabelecidas para avaliar a capacidade de proliferação na presença de antígenos.
