Esse modelo não só pode ser utilizado para explorar a patogênese da DAC, mas também é aplicável para a evolução pré-clínica de novos métodos terapêuticos, o que tem um significado importante. Este é um modelo animal estável e eficiente com muitas vantagens, como um curto período experimental, fácil operação, sintomas óbvios e uma alta taxa de sucesso. Nosso protocolo experimental é muito detalhado e fácil de operar.
Certifique-se de seguir cada etapa do protocolo corretamente. Antes de iniciar a modelagem, aclimate os ratos ao ambiente por uma semana com acesso gratuito a comida e água. No dia da modelagem, utilizando lâmpada ultravioleta e álcool 75%, limpe e desinfete o ambiente e as bancadas.
Aplique água e sabão no abdômen dos ratos usando um cotonete e raspe a área na direção do crescimento do cabelo com uma lâmina ou barbeador. Pese o rato e compare as variações de peso entre cada grupo. Antes de realizar a estimulação de sensibilização abdominal, garanta a recuperação completa de qualquer lesão menor na pele do abdômen de camundongo induzida pela depilação.
Prepare a solução de DNFB a 0,5% e dilua-a com acetona para mistura de azeite numa proporção de 4 para 1. Usando uma pistola de pipeta, sopre e misture 20 vezes para misturar completamente a solução DNFB. Aplicar 25 microlitros da solução de DNFB a 0,5% sobre o meio da área de barbear abdominal com um pipetter e espalhe levemente com o lado liso da ponta do pipetter para dispersá-lo uniformemente.
Após 30 segundos de estimulação com DNFB, coloque o rato numa gaiola vazia sem roupa de cama para evitar que o rato esfregue a solução de DNFB. Quando a solução estiver completamente seca, devolva o rato à sua gaiola original com livre acesso a comida e água. Para a estimulação da sensibilização da orelha, orientar o corpo do camundongo e fazer a borda externa da aurícula voltada para baixo para evitar que a solução entre no canal auditivo durante a estimulação com DNFB.
Nos dias 4 e 10, usando um pipetador, aplicar 20 microlitros do veículo, ou solução de DNFB 0,2% lenta e uniformemente na superfície interna da aurícula esquerda, e distribuir suavemente a solução usando o lado liso do pipetador. Deixe a orelha direita sem tratamento. Aguarde até que a solução de DNFB esteja seca e coloque o rato de volta na gaiola.
Após estimulação abdominal e de sensibilização do ouvido, pesar os ratos a cada dois dias a partir do primeiro dia. Comparar o peso de cada rato com o dia zero e avaliar o efeito da DCA no peso corporal dos ratinhos à medida que o peso muda. Capture fotos de alta resolução das orelhas de camundongos para registrar os sintomas clínicos da DCA a cada dois dias, começando no primeiro dia.
Usando paquímetro de Vernier, meça a espessura da aurícula no mesmo horário todos os dias para obter resultados precisos. Pare os paquímetros vernier de continuar o pinçamento para dentro quando houver um ligeiro bloqueio para evitar danos teciduais à orelha do rato. Mantenha a posição fixa e registre os dados para ambas as orelhas.
Registre a média dos três dados e avalie o inchaço da orelha em micrômetros. Para avaliar o grau de inchaço inflamatório no dia 11, prepare a solução corante azul de Evans a 0,5% e dilua-a com PBS. Para imobilizar o mouse com um fixador, abra a tampa, segure a cauda do mouse, faça a cabeça do mouse encarar o fixador e permita que o mouse instintivamente suba no fixador.
Tampe a tampa. Faça a cauda do mouse sair do orifício na tampa e ajuste o comprimento do fixador para expor toda a cauda do mouse. Limpe a cauda repetidamente com uma bola de algodão de álcool, ou mergulhe-a em água morna por 30 segundos, e aperte suavemente a raiz da cauda para encher e expanda as veias de ambos os lados.
Injete lentamente a solução Evans Blue Dye na veia da cauda do rato utilizando uma agulha de insulina de 1 mm sob a irradiação de uma fonte de luz fria. Aguarde 15 minutos para tirar fotos das orelhas do mouse. As orelhas de camundongos do grupo DNFB apresentaram sintomas clínicos evidentes comparáveis aos da DCA, com áreas sensíveis apresentando os sintomas típicos de vermelhidão, ressecamento, erosão e exsudação.
No entanto, a administração auricular de água pura ou controle com solvente não produziu sintomas semelhantes ao grupo DNFB. No grupo DNFB, comparado à orelha direita não tratada, a espessura da orelha esquerda aumentou significativamente após a estimulação com DNFB. Não houve diferença significativa nos grupos controle e veículo.
A orelha esquerda dos camundongos do grupo DNFB tornou-se azul escuro após a injeção do corante Azul de Evans, que era visualmente diferente da orelha direita. As orelhas esquerda e direita dos camundongos dos grupos controle e veículo eram aproximadamente da mesma cor. O ganho de peso dos camundongos foi ligeiramente retardado pela DNFB, ou estimulação veicular simples, mas não resultou em perda de peso significativa.
A estimulação repetida do DNFB na orelha de camundongos resultou em aumento do baço e aumento do índice esplênico. Em contraste, o índice de baço dos camundongos do grupo veículo não se alterou significativamente. Certifique-se de que a solução DINFB está totalmente misturada e aplicada uniformemente na orelha do rato sem fluir para o canal auditivo.
Essa é a chave para o sucesso da modelagem.
