O mecanismo de resistência às toxinas formadoras de poros é pouco compreendido. Nosso protocolo permite a função e o mecanismo para formar toxinas formadoras de poros usando Leishmania major, um sistema geneticamente tratável e fisiologicamente relevante. A principal vantagem do ensaio de citotoxicidade é comparar a viabilidade celular de múltiplos fenótipos em um nível de célula única em um ensaio de rendimento médio quando desafiado com toxinas em tempo real.
Agentes perturbadores de membrana, como a anfotericina B, são terapias de linha de frente para a Leishmania. Este ensaio permite a identificação de agentes que potencializam a anfotericina B e/ou novos agentes prejudiciais à membrana. Este ensaio fornece informações sobre áreas como resposta de reparo e vias de sinalização relacionadas a respostas de reparo.
Este ensaio pode ser aplicado a protozoários como Trypanosoma e Naegleria fowleri. As pessoas acham difícil entender a série de diluição em série de toxinas. Portanto, o melhor conselho que posso dar é desenhar um esquema da série de diluição em série antes de configurar o experimento.
Para começar, reserve 0,5 mililitros de promastigotas processadas em um tubo separado como controle não manchado. Adicione dois miligramas por mililitro de iodeto de propídio, ou PI, a uma concentração final de 10 microgramas por mililitro aos promastigotas restantes. Vórtice por três segundos.
Adicione promastigotas processadas a cada poço de uma placa de fundo em V, placa de 96 poços ou tubos de pântano, e coloque a placa ou o rack de tubos no gelo em um ângulo de aproximadamente 45 graus da visualização. Adicione 100 microlitros de tampão de ensaio com iodeto de propídio a cada controle sem toxina. Verifique se o controle foi adicionado corretamente identificando visualmente tubos com um volume total de 200 microlitros que parecem de cor mais escura.
Adicione o volume de toxina à diluição mais alta. Em seguida, dilua a toxina em série. Pipetar para cima e para baixo pelo menos oito vezes para garantir a mistura.
A partir da menor concentração de toxina, adicione rapidamente 100 microlitros de toxina à linha correta e continue até que toda a toxina tenha sido adicionada às células. Sele a placa com fita adesiva. Depois de incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos, embale e transporte a placa para o citômetro de fluxo.
Para a aquisição de dados, comece com a configuração do citômetro de fluxo e do software de aquisição de acordo com as instruções do fabricante e a política por instalação. Usando a amostra promastigota de L.major não corada, defina as portas para dispersão frontal e lateral e os parâmetros fluorescentes iniciais com base nos corantes escolhidos. Usando controles de coloração única, defina os portões para o corante de viabilidade e quaisquer toxinas marcadas fluorescentemente.
Monitore a dispersão para frente versus o tempo para microentupimentos e adquira mais de 10.000 eventos fechados para cada amostra no citômetro. Para a análise dos dados, paguente os promastigotas L.major totais de célula única, fechando a dispersão para frente e para os lados e o tempo, conforme necessário. Use altura ou área conforme recomendado para o citômetro de fluxo.
Identifique e paguente as células mortas como PI alto. Organize a curva dose-resposta no Excel para análise. Determine a porcentagem média de PI alta para cada condição entre as duas replicações técnicas.
Inclua a concentração de toxinas e a lise específica percentual médio, juntamente com detalhes experimentais e / ou cálculos brutos de PI percentual. Rotule mais quatro colunas como Modelado, Resíduos, Parâmetros e Valores de Parâmetro. Verifique se as primeiras colunas correspondem aos parâmetros experimentais, à concentração de toxinas e à porcentagem de lise específica.
Inicialize os parâmetros L, k e c inserindo os valores na coluna Valores do Parâmetro. Na coluna Modelado, crie o modelo logístico. Na coluna Resíduos, calcule o quadrado da diferença entre o número modelado e a lise específica real.
Na coluna Valores de Parâmetro, ao lado de SOMA, some todos os valores na coluna Resíduos. Na coluna Parameter Values, ao lado de LC50, inicialize a equação para calcular a CL50 a partir dos valores determinados. Abra o Solver na guia Dados.
Selecione o objetivo definido para ser a célula que contém a soma dos resíduos calculados. Altere as células variáveis para os valores de parâmetro de L, k e c.
Para valores k negativos, modifique equações fatorando uma negativa de k para mudar k para positivo. Use o método de Solução Não Linear GRG e clique em Resolver. Verifique a curva e se a LC50 é calculada automaticamente.
Verifique o ajuste plotando graficamente a porcentagem de lise específica e a modelagem contra a concentração de toxinas. Os promastigotas de knockout SPT2 deficientes em esfingolípidos foram sensíveis ao SLO tanto no M199 livre de soro quanto no tampão de Tyrode. Os promastigotas do tipo selvagem e do SPT2 add-back foram resistentes ao SLO no M199 livre de soro, mas apresentaram lise menos de 20% específica no tampão de Tyrode.
Os promastigotas knockout SPT2 foram aproximadamente oito vezes mais sensíveis ao SLO no tampão de Tyrode do que no M199. Estes dados demonstram que a sensibilidade à toxina pode variar com base no tampão utilizado. Uma banda de 120 quilodaltons foi observada para fosfo-MEK nos promastigotas de L.major.
Para MEK total, foram observadas bandas de cerca de 120 kilodaltons e 55 kilodaltons, que são consistentes com os tamanhos de MRK1 e LmxMKK, respectivamente. O fosfo-ERK detectou bandas semelhantes, enquanto a coloração do anticorpo ERK não foi robusta neste ensaio. A coisa mais importante a lembrar ao tentar este procedimento é garantir o manuseio adequado da toxina.
A Leishmania pode ser utilizada como um modelo geneticamente tratável para estudar o reparo da membrana plasmática, fornecendo novos insights sobre a mecânica de reparo da membrana durante a interação das bactérias Leishmania no intestino médio do flebotomíneo.
