Nosso protocolo descreve um sistema confiável para medir a contratilidade em cardiomiócitos primários humanos adultos. Nosso sistema é um método de gravação óptica não invasivo de médio rendimento que mede continuamente a contratilidade de várias células em paralelo e permite o rastreamento em tempo real dos efeitos de drogas. Nossos métodos apoiam a descoberta de novas moléculas com o perfil mais desejado para a correção da insuficiência cardíaca.
Também fornece uma abordagem pré-clínica para prever os riscos de contratilidade induzida por drogas. Para começar, coloque uma única tampa de vidro em cada poço de uma placa de cultura de oito poços. Prepare cinco microgramas por mililitro de laminina adicionando 800 microlitros do estoque de laminina recombinante humana 521 a 7,2 mililitros de solução B e misture bem.
Adicione 200 microlitros da solução de laminina diluída ao centro da lamínula. Tampe o prato e empilhe-o em uma geladeira de quatro graus Celsius. Diluir o dimetilsulfóxido ou DMSO 1000 vezes na solução C para fazer uma solução de veículo DMSO a 0,1%.
Para testar o composto em uma, 10, 100 e 1000 vezes de sua exposição terapêutica de 0,001 micromolar, dissolver o composto em DMSO em uma concentração milimolar. Diluir a solução do composto de ensaio DMSO em série com DMSO para produzir mais três reservas. Finalmente, diluir cada estoque de composto de teste de 1000 em 50 mililitros de solução C para obter as concentrações finais de teste.
Adicionar a solução do veículo e as soluções das concentrações micromolares finais do composto a seringas de 50 mililitros. Conecte as seringas ao sistema de fluxo por gravidade e, em seguida, acione o sistema de fluxo por gravidade. Remova uma placa de oito poços contendo uma tampa revestida de laminado para fora da geladeira e coloque uma tampa em uma câmara de gravação limpa.
Retorne o prato à geladeira até o próximo revestimento. Aspirar a solução B do frasco para injetáveis escalonado para atingir o menor volume sem perder células. Em seguida, distribua 200 microlitros da solução celular na câmara do microscópio de gravação montada no palco de um microscópio invertido e deixe que as células se acomodem na tampa por cinco minutos.
Em seguida, abra o campo de visão no microscópio e determine se a densidade celular é adequada para o início da execução experimental. Uma vez feito o plaqueamento, equilibre as células por cinco minutos, perfundindo-as continuamente com a solução C usando o sistema de perfusão por fluxo por gravidade. Ajuste a sucção corretamente, ligue a caixa de controle de temperatura e uma placa de aquecimento e configure-os para fornecer 35 graus Celsius.
Em seguida, em um estimulador de campo com um par de fios de platina colocados em lados opostos da câmara, estimule as células com tensão supralimiar em uma frequência de estimulação de um hertz. Ajuste a amplitude do pulso estimulador em um volt e aumente-o até que os cardiomiócitos comecem a gerar ciclos de contração-relaxamento. Selecione células saudáveis com morfologia em forma de bastonete e estrias claras, em seguida, ajuste o campo de visão e concentre-se em trazer o maior número possível de células em contração à vista.
Em seguida, foram exibidas as imagens digitalizadas das células dentro do software de aquisição do sistema de registro óptico de contratilidade. Ao selecionar a região de interesse ou ROIs, evite áreas fora de foco e áreas próximas à borda das células. Iniciar o experimento para avaliar os efeitos do composto.
O software de aquisição gerenciará a aquisição de dados. Exibição e rotulagem das concentrações de teste e tempo de tratamento automaticamente. Aplicar concentrações de ensaio se a contração se mantiver numa amplitude estável durante todo o período de referência do veículo.
Desqualificar células que exibem um runup ou rundown. Execute a análise off-line usando o software de análise e uma macro personalizada para calcular a média dos dados. O software calcula e reporta várias métricas a partir dos dados dinâmicos do sarcômero produzidos pelo software de aquisição.
Quantificar os efeitos do composto de teste na amplitude média de contratilidade em relação à condição de controle do veículo basal específica de cada cardiomiócito. Expresse os resultados médios como média de MEV mais/menos e produza um gráfico plotando o efeito da concentração do composto de teste na amplitude de contratilidade. Em seguida, ajuste a curva de resposta de concentração à equação de hill para derivar os valores de IC50 e EC50.
Em seguida, identifique a pós-contração como uma contração secundária espontânea transitória do cardiomiócito que ocorre antes da próxima contração regular e produz uma contração anormal e não sincronizada. Identificar falha de contração como a incapacidade do estímulo elétrico de induzir uma contração. Visualize a variabilidade de curto prazo, ou STV, e alternans em gráficos de Poincare da variabilidade da amplitude de contração.
Calcular o STV com os últimos 20 transientes de cada período de concentração do artigo de controle e teste. Em seguida, identifique alternantes como transientes de amplitude de contratilidade curtos e longos repetitivos, alternados. Para calcular as incidências de pró-arritmia, normalizar os valores de STV para o valor de controle do veículo de cada célula, plotar pós-contração, falha de contração, STV e alternans e expressá-los como um percentual da incidência de células exibindo cada um dos sinais.
Complete o perfil mecanístico multiparamétrico com o cálculo do tempo para o pico, decaimento para 30% e 90% de relaxamento, tempo para 90% de relaxamento, comprimento basal do sarcômero, tempo para 50% do pico, altura do pico, comprimento do sarcômero no pico de contratilidade, velocidade máxima de contração e velocidade máxima de relaxamento. Em seguida, expresse esses parâmetros relativos à condição de controle basal específica de cada cardiomiócito e os represente graficamente em gráficos de resposta à concentração. Este estudo mostra a validação da medida da contratilidade dos cardiomiócitos humanos e o efeito da estimulação beta-adrenérgica.
Não houve transientes espontâneos de contratilidade nos cardiomiócitos humanos, e os cardiomiócitos respondem à estimulação elétrica externa com ciclos de contratilidade-relaxamento, bem como ao isoproterenol, um agonista beta-adrenérgico. O isoproterenol produz um aumento concentração-dependente na contratilidade, e seus efeitos sobre a cinética de contratilidade transitória também foram caracterizados. Após a medição da contratilidade, podemos realizar a medição do transiente de cálcio com um indicador fluorescente.
Esses dados ajudam a determinar se a mudança na contratilidade requer mudança na dinâmica do cálcio. Nosso método abre caminho para que pesquisadores cardíacos desenvolvam uma melhor compreensão da fisiologia e farmacologia dos cardiomiócitos humanos, estabeleçam estrutura, atividade e relações de novas drogas e explorem seu mecanismo de ação.
