Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da sociedade americana de medicina reprodutiva e do Charles e Johanna Busch Memorial Fund na Rutgers, Universidade do estado de NJ para Konzen A.L.N. foi apoiada por uma concessão do N.I.H (F31 HD0989597).

1. molecular clonagem
<ol><li>Obter a sequência de código completo do gene de interesse e o plasmídeo em vitro transcrição (pIVT) vetor11. Nota: Clones de cDNA completos estão comercialmente disponíveis a partir de vários fornecedores ou podem ser gerados através da reação em cadeia da polimerase transcrição reversa (RT-PCR). Centro Nacional para recursos on-line Biotechnology Information (NCBI) fornece sequências de transcrição de genes do nucleotídeo e sequência expressa com a tag bancos de dados (EST). Para facilidade de proteína, visualização e análise dos níveis de expressão, fusão de proteína verde fluorescente (Gfp) ou outra marca fluorescente apropriada podem ser desejados na estratégia de clonagem.</li>
	<li>Usando uma estratégia de clonagem validada, inserir a sequência de codificação do gene de interesse para a região de clonagem múltipla de pIVT. Uma descrição detalhada da clonagem molecular e as etapas necessárias foram anteriormente descrito 12. Nota: Se um produto do gene de fusão é para ser gerado, certifique-se de que a clonagem é no quadro de leitura.</li>
	<li>Sequenciar a construção usando primeiras demão de globina para garantir a inserção do gene correto, fusão de em-frame adequada, e que foram criadas sem mutações de ponto induzida pela polimerase. Nota: Se não houver equipamentos de sequenciamento de DNA de Sanger, muitas empresas oferecem baixo custos opções de sequenciamento de DNA.</li>
	<li>Mutagenize DNA se gerando polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou inserções/exclusões (PUNTUAIS). Mutagênese do DNA é descrito em etapas 1.5-1.7 abaixo. Para construções de tipo selvagem, prossiga com a etapa de linearização 1.7.</li>
	<li>Projetar primers mutagênese e completar a reação de PCR de mutagênese para gerar mutante construção de acordo com o protocolo do fabricante. Mediada por PCR mutagenesis local-dirigido tem sido descrito anteriormente 13. Além disso, muitas empresas oferecem kits de mutagenesis local-dirigido que incluem protocolos.</li>
	<li>Transforme mutagenized DNA bacteriano hospedeiro. Isolar e purificar o plasmídeo. Nota: Muitas empresas fazem kits que podem ser usados para isolar e purificar o Plasmídeo facilmente. Segui o protocolo de fabricantes em conformidade. Se usando uma estirpe bacteriana gram-negativa, tais como Escherichia coli, é recomendável usar um kit que remove endotoxinas.</li>
	<li>Sequenciar o DNA isolado de transformants bacteriana usando sequenciamento de DNA de Sanger padrão para confirmar a introdução do SNP ou INDEL desejado.</li>
	<li>Linearizar produtos finais usando digestão única enzima de restrição do DNA purificado. Nota: O vetor pIVT contém vários single-enzima cortar sites listados no mapa do plasmídeo na Addgene 14.</li>
	<li>Certifique-se de que o produto é linear através de eletroforese em gel de agarose. A metodologia de eletroforese em gel de agarose foi anteriormente definido 14. Nota: Para todas as etapas restantes, use materiais livre de RNase e pontas de pipeta de barreira (filtro) para garantir uma produção estável, de alta qualidade do RNA.</li>
	<li>Purificar o produto digerido usando um protocolo de limpeza de DNA ou kit de validado e eluir em água de RNase/DNase-livre 30 µ l. Nota: Rotação de sílica-matriz kits baseada na coluna são recomendados para a alta qualidade, purificado de DNA. Segui o protocolo de fabricantes em conformidade.</li>
	<li>
Em vitro transcrever DNA utilizando polymerase T7, seguindo o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Purificar e eluir RNA em 30 µ l de água livre de RNase/DNase usando um kit de purificação baseada na coluna de ácidos nucleicos de rotação sílica-matriz seguindo o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Execute a desnaturação electroforese do gel do agarose usando formaldeído para confirmar o tamanho do produto final do RNA. Ver etapas 1.13-1,22 abaixo 14. (Figura 1).</li>
	<li>Preparar o gel por aquecimento de 1 g agarose em 72 mL água até dissolver e, em seguida, fixe a 60 ° C.</li>
	<li>Prepare-se 10 X MOPS executando tampão adicionando MOPS 0,4 M (pH 7,0), acetato de sódio 0,1 M e 0,01 M EDTA.</li>
	<li>Adicione 10 mL de 10 X MOPS executando o buffer e 18 mL de formol 37% (12,3 M) para a solução de agarose refrigerado.</li>
	<li>O gel derramando a solução de agarose em um recipiente de formar gele de casta. Use um pente grande o suficiente para acomodar 10 µ l. Depois de gel tem conjunto e é firme ao toque, retire com cuidado o pente.</li>
	<li>Montar o gel no tanque de electroforese e adicionar suficiente 1 X MOPS executando reserva, garantindo que o gel está completamente coberto.</li>
	<li>Prepare a amostra de RNA adicionando 1 µ g de RNA para 0,5 volumes X de corante de carregamento que contenham formaldeído.</li>
	<li>Brometo de etídio adicione solução de RNA em uma concentração de 10 µ g/mL.</li>
	<li>Desnature a solução de amostra de RNA em 70 ° C por 5 min.</li>
	<li>Usando-se estéril, 10 µ l filtro dicas, carregar 5 µ l de marcador de peso molecular e 5 µ l de RNA amostra em separado poços do gel e electrophorese em 5 V/cm até que a tintura tem migrado pelo menos dois terços do comprimento do gel.</li>
	<li>Visualize o RNA no gel um iluminador de trans de UV. Certifique-se do que RNA é o tamanho correto, comparando com o marcador de peso molecular.</li>
	<li>Para medir a concentração e a pureza do RNA, transferi 1,2 µ l de RNA purified usando estéril 10 µ l filtro dicas em um espectrofotômetro UV. Observe que o RNA de alta qualidade deve ter relações de absorvância de A260/280 (1.8-2.2) e 260/230 (> 1.7) respectivamente.</li>
	<li>Usando o RNA purified restante de 10 µ l filtro dicas, alíquotas estéril 0,5 µ l centrifugar os tubos (3-5 µ l/tubo). Armazenar os tubos a-80 ° C até que esteja pronto para o microinjection. Nota: Uma concentração final de injeção de 500 ng / µ l é um ponto de partida ideal. Recomenda-se diluir o RNA 1:2 em RNase H20 antes da microinjeção para reduzir a viscosidade do RNA em pipeta de microinjeção de grátis.</li>
</ol>2. cinetócoro Microtubule-acessório de ensaio
<ol><li>Divida oócitos em grupos iguais para o microinjection. Nota: Coleção de oócito, transferência, microinjeção e maturação meiose tem sido descrito em detalhes em Júpiter anteriormente 15.</li>
	<li>Microinjeção de um grupo com mRNA experimental e o outro grupo (s) com o controle WT e PBS ou Gfp mRNA. Nota: 500 ng / µ l é a concentração de injeção recomendada para começar com 10. Um picoinjector pode ser usado para controlar quantidades de injeção. Recomenda-se um volume de injeção de 5-10 pL 15.</li>
	<li>Utilizando uma mão ou boca aparelho pipetagem operado, onde o vidro Pipetar abertura é ligeiramente maior que o diâmetro de um oócito (100-150 µm), oócitos de transferência em uma gota de 100 µ l do meio de cultura livre de milrinona em uma placa de Petri coberto de embrião óleo mineral de qualidade e incube-os oócitos para 7 h a 37 ° C em 5% C02 para permitir a maturação suficiente para metáfase da meiose eu (-se) 15.</li>
	<li>Após a incubação, usando o mesmo aparelho de pipeta como acima, transferência de oócitos em um prato de cultura do centro-bem órgão contendo 700 µ l de meio de coleção mídia essencial mínimo pre-refrigerados (MEM) no centro bem e 500 µ l H20 no anel exterior e Coloque o prato no gelo por 7 min. Nota: É aconselhável pre-chill mídia MEM e centro bem pratos de cultura órgão a-20 ° C durante pelo menos 20 min antes do tratamento de ovócitos.</li>
	<li>Corrigi os oócitos por transferi-los usando o aparato da pipeta em um poço de uma placa de vidro desobstruído local contendo 400 µ l de 2% paraformaldeído em 1X PBS por 20 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Mesmo usando Pipetar aparelhos, transferência de oócitos em outro poço num prato local contendo 400 solução de bloqueio µ l (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN3) e loja a 4 ° C até que esteja pronto para processar por imunocoloração. Nota: para armazenar oócitos a 4 ° C, tampa de vidro placa local com parafilm para evitar a evaporação.</li>
	<li>Usando o mesmo aparelho de pipeta, oócitos de transferência para um novo poço em um ponto da placa contendo solução de permeabilização 400 µ l (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3) e incubam a temperatura ambiente por 20 min. de oócitos de transferência rapidamente através de três gotas de 400 µ l obstrui a solução para remover os resíduos de detergente. Nota: Uma placa de vidro desobstruído 9-poço local funciona bem para mover grupos através de vários tratamentos em um único prato (etapas 2.4-2.5).</li>
	<li>Execute os demais procedimentos de imunocitoquímica em uma câmara umidificada, protegido da luz em temperatura ambiente. Uso um recipiente de plástico de tamanho médio forrada com toalhas de papel húmido e cubra com papel alumínio.</li>
	<li>Usando o aparelho de pipeta, transferência de oócitos para 30 µ l obstrui a solução sobre a tampa de uma placa de 96 poços e lugar dentro da câmara umidificada por 10 min. Nota: Gotas são colocadas nos circulares recuos na placa.</li>
	<li>Para rotular centrómeros e o eixo, usando o aparato de pipeta, transferência de oócitos para 30 µ l obstrui a solução contendo o antígeno anti-DNA (ACA, crista) (01:30) e antiacetilado tubulina (1: 1000) e incube pelo menos 1 h.</li>
	<li>Enxágue oócitos por transferência através de gotas de três 30 µ l de obstrui a solução durante 10 minutos cada.</li>
	<li>Usando o aparelho de pipeta, transferência de oócitos para um 30 µ l gota de solução de bloqueio contendo anticorpos secundários cortesia para os anticorpos usados acima (anti-humano IgG 1: 200, 1: 200 do anti-rato IgG) e incube por 1h.</li>
	<li>Repita as etapas de lavagem 3, 10-min em 30 µ l obstrui a solução conforme descrito na etapa 2.11.</li>
	<li>Transferência de oócitos, usando o aparelho de pipeta, em 3-5 µ l montagem médio contendo DAPI (5,9 µ g / µ l) sobre uma lâmina de vidro de microscópio.</li>
	<li>Coloque 4 gotas pequenas (tamanho de uma cabeça de alfinete) de vaselina nos cantos da lamínula para evitar o esmagamento de oócitos.</li>
	<li>Coloque delicadamente o lado de vaselina deslizamento da tampa para baixo para o slide.</li>
	<li>Selo da lamela bordas com esmalte transparente e deixe para secar por 5 min.</li>
	<li>Armazenar slides a 4 ° C, protegido da luz, até o processamento através de microscopia confocal. Nota: Certifique-se o índice de refração do meio de montagem e lamela, correspondências os objectivos do microscópio a ser utilizados. Montagem de recomendados materiais anteriormente tem sido descrito 15.</li>
	<li>Imagem de oócitos usando um objectivo de x 40-63 em um microscópio confocal, capturando pequenos passos (≤ 1 µm) no plano z, otimizado para o objetivo do trabalho e a imagem toda a região do fuso da metafase. Nota: Certifique-se de todos os 3 canais com base em anticorpos secundários específicos utilizados na etapa 2.11 de imagem. Imagem média ≥ 4 e um zoom de 3 é ideal para a resolução adequada. Um tamanho de passo 1 µm fornece visualização clara dos microtúbulos e cinetócoros em oócitos de rato. O procedimento para a captura de imagem irá variar de microscópio para microscópio. Por favor, consulte o guia de usuário confocal de fabricantes para etapas específicas sobre como definir configurações de microscópio.</li>
	<li>Identifica o status de acessório de cinetócoro-microtubule usando software de imagem seguindo passos 2.21-2,23 abaixo. Nota: As seguintes etapas descrevem esse procedimento usando o software para download gratuito de imagem J (NIH), no entanto, o software alternativo de imagens pode ser usado. Status de acessório tipos anteriormente foram definidas 16 .</li>
	<li>Abrir imagem arrastando o arquivo para a barra de ferramentas imagem J.</li>
	<li>O z-série aberto, certifique-se de todos os canais visíveis (DNA, cinetócoro e eixo), clicando em "mesclar canais", disponível no menu drop-down "imagem", "cor" na guia sub.</li>
	<li>Utilizando o toggle na parte inferior da imagem, percorrer cada fatia-z e determinar a penhora de microtubule cinetócoro. Acessório de detalhadas descrições foram previamente descrito 16
</li>
</ol>3. ensaio de desafio de alinhamento de cromossomo
<ol><li>Usando o aparelho de pipeta, conforme descrito na etapa 2.3, transferência de oócitos em uma gota de 100 µ l do meio de cultura livre de milrinona sob óleo e incubar oócitos para 7 h permitir a maturação suficiente para metáfase da meiose eu (-se) como descrito anteriormente na etapa 2.3 17 . Nota: Procedimentos de coleção, microinjeção e maturação do oócito foram descritos anteriormente, 15. Consulte o protocolo de ensaio do apego em passos 2.1-2.2 para controles e para as concentrações de microinjeção de RNA.</li>
	<li>Usando o mesmo aparelho de pipeta, transferência de oócitos para uma cultura de centro-bem órgão prato contendo meio de cultura de 700 µ l contendo monastrol [100 µM] no centro bem e 400 µ l H20 no anel circundante e incubam a 37 ° C por 2 h.</li>
	<li>Lavar monastrol pela transferência de oócitos, usando o aparato de pipeta como acima, através de três gotas de meio de cultura CZB de 100 µ l e depois transferir os oócitos para um prato de cultura centro-bem órgão novo contendo 700 µ l meio de cultura + MG132 [5 µM] para 3h no centro anel. Adicione 400 µ l H20 para o anel exterior.</li>
	<li>Corrigi os oócitos transferindo-os, usando o aparelho de pipeta, num poço de uma placa de ponto de vidro transparente contendo 400 paraformaldeído µ l 2% em PBS por 20 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Após a fixação, transferência de oócitos, usando o aparelho de pipeta, em um novo poço de uma placa de ponto de vidro transparente contendo 400 µ l solução de bloqueio e loja a 4 ° C até processados por imunocoloração. Nota: para armazenar oócitos a 4 ° C, tampa de vidro placa local com parafilm para evitar a evaporação.</li>
	<li>Permeabilize e rotular oócitos através de imunocitoquímica, conforme descrito nas etapas 2.6-2.16.</li>
	<li>Oócitos usando um objectivo de x 40-63 em um microscópio confocal, captura de imagem < 1 µm passos no plano z certificando-se de toda a região do fuso da metafase da imagem.</li>
	<li>Para identificar o alinhamento do cromossomo status de abrir arquivos de imagem usando o software de imagem. Nota: As seguintes etapas descrevem esse procedimento usando o software para download gratuito de imagem J (NIH), no entanto, o software alternativo de imagens pode ser usado.</li>
	<li>Arraste a imagem no painel de controle de imagem J.</li>
	<li>O z-série aberto, use a ferramenta de ponto (disponível clicando no ícone de ferramenta do ponto na barra de controle de imagem J) para marcar pontos no final de cada polo do fuso em seu respectivo z-fatia colocando a ferramenta sobre o polo do eixo da imagem e clicando na imagem. Adicione estes pontos para a região de Gerenciador de interesse (ROI) pressionando Command + t no teclado.</li>
	<li>Determine as coordenadas específicas para cada uma das posições definidas na etapa 3.10 destacando o ponto específico no Gerenciador de ROI e clicando no botão de medida. Isto proporcionará um resultados contendo a tabela x e y coordenadas para cada ponto. Estes serão os pontos X1, Y1 e X1, Y2, respectivamente.</li>
	<li>Em seguida, determine a coordenada Z de verdade. Isto é feito multiplicando o número de fatia da z-fatia específica na z-pilha na qual foi identificado o polo do eixo (ou seja, fatia #2 de 6) cada ponto individual está em, a espessura da pilha (ou seja, 1 µm) (exemplo: cortar 2 x 1 µm = 2). Estes serão os pontos Z1 e Z2, respectivamente.</li>
	<li>Determinar o comprimento do fuso, usando a equação do teorema de Pitágoras (a2 + b2 = c2) usando o definidos anteriormente x, y e z as coordenadas da escadaria 3.11-3.13. Para cada eixo, o comprimento final é igual a: √((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>Determine a midzone do eixo. Isto é calculado como a metade do comprimento do fuso. Usando a ferramenta de linha de imagem J, clicando no ícone de linha na barra de ferramentas imagem J, desenhe uma linha que vai de um polo do eixo do midzone do eixo. O comprimento será exibido na barra de ferramentas imagem J.</li>
	<li>Determine o status de alinhamento do cromossomo, avaliando a distância de cromossomo do midzone eixo usando a ferramenta de medição da linha. Usando a ferramenta de linha disponível clicando no ícone de linha na barra de ferramentas imagem J, desenhe uma linha de midzone do eixo para o cromossomo. O comprimento será exibido na barra de ferramentas imagem J. Maiores que 4 µm de midzone do eixo de cromossomos são considerados desalinhada 18.</li>
</ol>

<ol><li>Thoma, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+infertility+in+the+United+States+as+estimated+by+the+current+duration+approach+and+a+traditional+constructed+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach.</a> Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).</li>
<li>Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+estimates+of+infertility+prevalence+and+treatment-seeking%3A+potential+need+and+demand+for+infertility+medical+care%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care.</a> Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).</li>
<li>Treff, N. R., Zimmerman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Preimplantation+Genetic+Testing+for+Monogenic+Disease+and+Aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).</li>
<li>Franasiak, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+aneuploidy+with+increasing+age+of+the+female+partner%3A+a+review+of+15%2C169+consecutive+trophectoderm+biopsies+evaluated+with+comprehensive+chromosomal+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening.</a> Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Scott, R. T. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocyst+biopsy+with+comprehensive+chromosome+screening+and+fresh+embryo+transfer+significantly+increases+in+vitro+fertilization+implantation+and+delivery+rates%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial.</a> Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).</li>
<li>Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage-stage+biopsy+significantly+impairs+human+embryonic+implantation+potential+while+blastocyst+biopsy+does+not%3A+a+randomized+and+paired+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial.</a> Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+single+blastocysts+for+fresh+transfer+via+standard+morphology+assessment+alone+and+with+array+CGH+for+good+prognosis+IVF+patients%3A+results+from+a+randomized+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study.</a> Mol Cytogenet. 5 (1), 24(2012).</li>
<li>Rubio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilization+with+preimplantation+genetic+diagnosis+for+aneuploidies+in+advanced+maternal+age%3A+a+randomized%2C+controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study.</a> Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).</li>
<li>Nguyen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+Aurora+Kinase+B+and+C+variants+associated+with+maternal+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy.</a> Mol Hum Reprod. , (2017).</li>
<li>Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+PLCbeta1+in+mouse+eggs+change+calcium+oscillatory+behavior+following+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization.</a> Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> JoVE. , (2017).</li>
<li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23906918">PCR-mediated site-directed mutagenesis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).</li>
<li>Armstrong, J. A., Schulz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArmstrong%2C+JA+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22">Current Protocols Essential Laboratory Techniques</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).</li>
<li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+oocyte+microinjection%2C+maturation+and+ploidy+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
<li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+and+force+behind+kinetochore+orientation%3A+lessons+from+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).</li>
<li>Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+kinase+B+modulates+chromosome+alignment+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes.</a> Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).</li>
<li>Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+anaphase-promoting+complex+activation+in+mouse+oocytes+is+predicted+by+microtubule-kinetochore+attachment+but+not+by+bivalent+alignment+or+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension.</a> Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).</li>
<li>Nguyen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+threonine+3+on+histone+H3+by+haspin+kinase+is+required+for+meiosis+I+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).</li>
<li>Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+maturation+involves+compartmentalization+and+opposing+changes+of+cAMP+levels+in+follicular+somatic+and+germ+cells%3A+studies+using+selective+phosphodiesterase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors.</a> Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).</li>
<li>Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+spindle+assembly+mechanisms+with+monastrol%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+the+mitotic+kinesin%2C+Eg5%5BTitle%5D)+AND+%22Eg5.+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5.</a> Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).</li>
<li>Jones, K. T., Lane, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li>
<li>Fellmeth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+three+Aurora+kinase+C+splice+variants+found+in+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).</li>
<li>Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+cold-stable+kinetochore+fiber+in+metaphase+PtK1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells.</a> Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).</li>
<li>Brunet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+fibers+are+not+involved+in+the+formation+of+the+first+meiotic+spindle+in+mouse+oocytes%2C+but+control+the+exit+from+the+first+meiotic+M+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase.</a> J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Devido a rápida e crescente identificação do humanas variantes genéticas associadas com a doença, é essencial que os sistemas são estabelecidos para avaliar seu significado biológico. Compreensão da função das proteínas na meiose humana coloca desafios específicos porque oócitos humanos são preciosos e raras e humana de esperma não é passíveis de manipulação genética. Oócitos mouse são um sistema de modelo mamíferos valioso para avaliar o gene humano meiótica função 10<s...

Infertilidade é uma condição que afeta 10-15% da população humana da idade reprodutiva 1, dos quais quase metade procura tratamento médico 2. Embora a etiologia da infertilidade é diversa e em muitos casos multifatoriais, a anomalia genética mais comum em seres humanos é embrionário aneuploidia 3. Aneuploidia é definida como o desvio (ganho ou perda) do número correto de cromossomos em uma célula. O fenômeno de aneuploidia em embriões humanos é comum e aumenta com a idade materna avançada, 4,5. Quatro ensaios controlados randomizados evidenciaram o benefício da seleção de embriões (euploid) apenas cromossomicamente normais para transferência uterina porque esta estratégia resultou na implantação de aumento de taxas, menores taxas de aborto e um menor tempo para alcançar a gravidez 6,7,8,9. Portanto, compreender a etiologia da aneuploidia humana pode ter implicações importantes na reprodução assistida.
Embora o teste genético pré-implantação para aneuploidies é benéfica em tratamentos de infertilidade, continua a faltar uma compreensão completa de como originou aneuploidies. É amplamente aceito que existe uma correlação positiva de aneuploidies meióticas (originou-se durante a produção de gametas) e a idade materna, no entanto, algumas taxas de aneuploidia embrionário presente mulheres que desviam a taxa média para sua idade determinada 4. Estes casos sugerem que idade sozinha nem sempre é preditiva do risco de gerar um embrião aneuploid. Outros fatores podem desempenhar um papel no aumento do risco de aneuploidia embrionária, tais como variantes do gene.
Um aspecto fundamental de investigar o potencial de contribuição de uma variante do gene de aneuploidia durante a meiose oócito é projetar um sistema para avaliar rapidamente a função do gene meiótica. Devido a restrições éticas e acesso limitado, é impraticável para realizar esses experimentos usando ovos humanos. Estas questões podem ser contornadas usando oócitos de rato, e aqui uma série de ensaios para avaliar a função do gene humano durante a meiose são descritos. Por microinjecting a codificação do RNA mensageiro (mRNA) para a variante do gene de interesse, a localização da proteína humana no ovo do mouse pode ser visualizada e usada para determinar se a expressão ectópica da proteína humana tipo selvagem e mutante resulta em qualquer alterações fenotípicas que poderiam levar à aneuploidia. Estes fenótipos incluem um aumento no microtúbulos que anexar para o inadequado à irmã cinetócoro e a incapacidade de apoiar o alinhamento de cromossomos em metáfase da meiose I. importante, este protocolo pode ser usado para investigar tanto ganho e perda de função variantes genéticas através do estabelecimento de condições experimentais específicas para desafiar os principais eventos na meiose oócito tais como eixo de alinhamento edifício e cromossomo 10.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL Seal-Rite PCR tube</td><td>USA Scientific</td><td>1602-4300</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>6X DNA loading Dye</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>9-well glass spot plate</td><td>Thomas Scientific</td><td>7812G17</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21050</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21091</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>VWR</td><td>AA0356</td><td></td></tr><tr><td>Anti-vibration table</td><td>Technical Manufacturing Corp</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Anti-Acetylated Tubulin antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7451</td><td>1:100 diution</td></tr><tr><td>Anti-centromeric (CREST) antibody</td><td>Antibodies Incorportated</td><td>15-234</td><td>1:30 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Barrier (Filter) Pipette tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12635</td><td>Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0445-07-6</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubing</td><td>Sutter</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Center Well organ culture dish</td><td>VWR</td><td>25381-141</td><td></td></tr><tr><td>CO2 tank</td><td></td><td></td><td>For incubator</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Centrifuge (With cooling ability)</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>any standard model&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cover Glass 11 x 22 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663F10</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663-F10</td><td>thickness will vary for particular microscopes</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DEPC H20</td><td>Life Technologies</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>888700001</td><td></td></tr><tr><td>Easy A high fidelity cloning enzyme</td><td>Agilent</td><td>600400</td><td>For DNA cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Enzymes for linearizing pIVT</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>NdeI or KasI can be used</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Thermo Scientific</td><td>155585011</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Any Fluorescent microscope may be used</td></tr><tr><td>Formaldehyde (37%)</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>9311</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde RNA loading dye</td><td>Ambion</td><td>8552</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Full Length cDNA Clones</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones</td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Globin Forward Primer for pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5&#039;- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3&#039;.&amp;nbsp; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td></tr><tr><td>Globin Reverse Primer for pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5&#039;- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3&#039; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td></tr><tr><td>Holding pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td>Vacutip</td></tr><tr><td>Humidified Chamber</td><td></td><td></td><td>Tupperware can be used</td></tr><tr><td>Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads</td><td>GE Life Sciences</td><td>27925901</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>any standard model with CO2 and water jacketed technology</td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon instruments</td><td></td><td>Any Standard model</td></tr><tr><td>Image J (NIH) Software</td><td>NIH</td><td></td><td>Image Analysis software</td></tr><tr><td>Lid of 96 well plate</td><td>Nalgene Nunc International</td><td>263339</td><td></td></tr><tr><td>Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>MacVector&amp;nbsp;</td><td>MacVector</td><td></td><td>Sequence analysis software</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Millenium RNA Markers-Formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4659</td><td>Resuspend in DMSO at 2.5mM</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Only used embryo-tested, sterile-filtered</td></tr><tr><td>Monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td>Resuspend in DMSO at 100 mM</td></tr><tr><td>Mouthpiece</td><td>Biodiseno</td><td>MP-001-Y</td><td></td></tr><tr><td>N2 tank</td><td></td><td></td><td>for antivibration table</td></tr><tr><td>Nail Polish; Clear</td><td></td><td></td><td>Any clear nailpolish can be used</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8676</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8671</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td><td>Thermo Scnentific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Organ Culture Dish 60x15mm</td><td>Life Technologies</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Polysciences, Inc.&amp;nbsp;</td><td>577773</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 139 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>501V</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 60 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Picoinjector</td><td>XenoWorks Digital Microinjector</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Flaming-Brown Micropipette puller</td><td>Model P-1000</td><td></td></tr><tr><td>pIVT plasmid</td><td>AddGene</td><td>32374</td><td>Empty vector suitable for oocyte expression.</td></tr><tr><td>Pregnant Mare Serum Gonadotropin</td><td>Lee BioSolutions</td><td>493-10</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>purification of up to 20 uL of plasmid DNA</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange II site directed mutagenesis kit</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>200523</td><td>mutagenesis kit for insertions and deletions</td></tr><tr><td>Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>210512</td><td>mutagenesis kit for single site changes</td></tr><tr><td>Scissors (Fine point)</td><td>Fine science tools</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Scissors (Medium point)</td><td>Fine science tools</td><td>WP114225</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Slide Warmer</td><td></td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Spectrophotometer (Nanodrop)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD Bioscienes</td><td>309623</td><td>1 ml, 27G(1/2)</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>x-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer (Fine point- Size 5)</td><td>Fine science tools</td><td>SN.743.12.1</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>UVP UV/White lite transilluminator</td><td>Fisher Scientific</td><td>UV95041501</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis i

Aneuploidia embrionária é a genética das principais causas de infertilidade em seres humanos. A maioria destes eventos se originam durante a meiose feminina, e embora positivamente correlacionada com a idade materna, idade sozinha nem sempre é preditiva do risco de gerar um embrião aneuploid. Portanto, variantes do gene podem contabilizar segregação do cromossomo incorreta durante a ovogênese. Dado que o acesso aos oócitos humanos é limitado para fins de pesquisa, uma série de ensaios foram desenvolvidos para estudar a função do gene humano durante a meiose I usando oócitos de rato. Primeiro, o RNA mensageiro (mRNA) do gene e variante do gene de interesse são injetadas em oócitos de rato prendi prófase. Após permitir tempo para expressão, oócitos sincronicamente são liberados na maturação meiose para completar a meiose eu. Marcando o mRNA com uma sequência de um repórter fluorescente, tais como a proteína verde fluorescente (Gfp), a localização da proteína humana pode ser avaliada para além das alterações fenotípicas. Por exemplo, ganho ou perda de função pode ser investigada através do estabelecimento de condições experimentais que desafiam o produto do gene para corrigir erros meióticos. Embora este sistema é vantajoso em investigar a função da proteína humana durante a ovogênese, adequada interpretação dos resultados deve ser realizada, dado que a expressão da proteína não está em níveis endógenos e, se não for controlada por (ou seja batido para fora ou para baixo), homologs murino também estão presentes no sistema.

Após in vitro transcrição RNA de alta qualidade terão uma relação A260/A280 (1.8-2.2) e um ≥1.7 de relação A260/A230 quando medido utilizando um espectrofotômetro. A imagem na Figura 1 mostra a migração do in vitro-produzido RNA em um gel de agarose a desnaturação, após eletroforese. Uma banda que é manchada no padrão ou uma amostra que tem várias faixas de tamanhos pode indicar a contaminação ou degradação da amostra....

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Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

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8.8K visualizações.  IVI-RMA New Jersey. Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.

Vídeo: Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

Investigação baseado no RNA de interferência da função da proteína de choque térmico 27 ​​durante a cicatrização de feridas da córnea epitelial

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Genética

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Isolamento e Caracterização do mouse Antral Oócitos Baseado em Nucleolar organização da cromatina

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted reproduction also allows for the production of embryos from high performers without interrupting their sports career and contributes to an increase in the number of foals from mares of high genetic value. The present manuscript describes the procedures used for collecting immature and mature oocytes from horse ovaries using ovum pick-up (OPU). These oocytes were then used to investigate the incidence of aneuploidy by adapting a protocol previously developed in mice. Specifically, the chromosomes and the centromeres of metaphase II (MII) oocytes were fluorescently labeled and counted on sequential focal plans after confocal laser microscope scanning. This analysis revealed a higher incidence in the aneuploidy rate when immature oocytes were collected from the follicles and matured in vitro compared to in vivo. Immunostaining for tubulin and the acetylated form of histone four at specific lysine residues also revealed differences in the morphology of the meiotic spindle and in the global pattern of histone acetylation. Finally, the expression of mRNAs coding for histone deacetylases (HDACs) and acetyl-transferases (HATs) was investigated by reverse transcription and quantitative-PCR (q-PCR). No differences in the relative expression of transcripts were observed between in vitro and in vivo matured oocytes. In agreement with a general silencing of the transcriptional activity during oocyte maturation, the analysis of the total transcript amount can only reveal mRNA stability or degradation. Therefore, these findings indicate that other translational and post-translational regulations might be affected.
Overall, the present study describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize the horse oocyte, a cell type that is extremely challenging to study due to low sample availability. However, it can expand our knowledge on the reproductive biology and infertility in monovulatory species.

This manuscript describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize horse oocytes. Specifically, the present work illustrates how to collect immature and mature horse oocytes by ultrasound-guided ovum pick-up (OPU) and how to investigate chromosome segregation, spindle morphology, global histone acetylation, and mRNA expression.

Análise da segregação cromossômica, acetilação de histona e morfologia do fuso em ovócitos de cavalo

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Identificando danos ao DNA em oócitos de camundongos com prisão de prófase

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Autor em destaque: Compreendendo a resposta a danos no DNA em oócitos de mamíferos e embriões pré-implantação 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Biologia

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Resumo

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Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Isolamento e Caracterização do mouse Antral Oócitos Baseado em Nucleolar organização da cromatina

Análise da segregação cromossômica, acetilação de histona e morfologia do fuso em ovócitos de cavalo

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

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Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA

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