Este protocolo tem um alto impacto no campo da descoberta e desenvolvimento de drogas, especialmente no desenvolvimento de novas drogas de primeira classe com efeitos colaterais mínimos. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser aplicada a qualquer sistema GPCR, e usada para obter informações precisas sobre farmacologia receptora em sistemas de vida em tempo real. As implicações desta técnica estão intimamente relacionadas a novas terapias, particularmente onde as beta-prendeções são relevantes.
Estes incluem receptores de opiod em receptores de dor e dopamina na esquizofrenia. Este método pode ser útil em muitas áreas de pesquisa científica médica, da neurologia à doença cardiopulmonar. A demonstração pcr do nosso método é importante, pois permite uma apresentação detalhada das etapas críticas no protocolo, o que não seria possível com a publicação convencional.
Comece projetando primers para introduzir genes de interesse aos vetores pBiT. Devido ao codon de parada de inframe que divide o site de multi-clonagem, selecione pelo menos um dos três locais como uma das duas enzimas de restrição únicas necessárias para clonagem direcional. Consulte o manuscrito para sequências de nucleotídeos para codificar os resíduos do linker e incorporá-los nos primers.
Para o pBiT1.1-C e pBiT2.1-C certifique-se de que o primer dianteiro contém um códon ATG e uma potente sequência de consenso Kozak. Para o pBiT1.1-N e pBiT2.1-N certifique-se de que o primer reverso contenha um códon stop. Use os primers projetados para amplificar o DNA de inserção do gene de interesse.
Combine os reagentes PCR de acordo com as instruções do manuscrito, certificando-se de usar uma polimerase de DNA de alta fidelidade para minimizar mutações. Programe o termociclador e inicie a reação. Após completar o PCR, digerir o produto em uma reação de digestão de 50 microliter.
Em um tubo de 1,5 mililitro, combine 12 microliters de água destilada, cinco microliters do tampão de digestão de restrição 10X apropriado e 30 microliters do produto PCR. Em seguida, adicione 1,5 microliters de cada enzima de restrição. Vórtice a mistura de reação.
E incubar durante a noite a 37,5 graus Celsius. Prepare uma segunda reação para digerir o plasmídeo receptor. Em um tubo de 1,5 mililitro, combine 23 microliters de água, cinco microliters do tampão de digestão de restrição de 10X apropriado, 15 microlitrais do plasmídeo receptor e 1,5 microlitres de cada enzima de restrição.
Misture brevemente o tubo. E incubar durante a noite a 37,5 graus Celsius. No dia seguinte à clonagem e transformação, escolha de três a dez colônias bacterianas individuais e transfira-as para um mililitro de meio LB com ampicillina.
Incubar as células por seis horas. E então transfira 200 microliters de suspensão bacteriana para cinco mililitros de meio LB fresco com ampicillina. Incubar a cultura a 37,5 graus Celsius com agitação a 200 rpm durante a noite.
No dia seguinte, isole o plasmid com um mini-kit de purificação de DNA. Trie o plasmídeo purificado para uma ligadura bem sucedida com PCR. Um dia antes da transfecção, semeou as células em uma placa de 96 poços revestido de poli-L-lysina usando o meio modificado da Águia de Dulbecco suplementado com soro bovino 10% fetal, 100 unidades por mililitro de penicilina G, e 100 microliters por mililitro de estreptomicina.
Adicione apenas células aos 60 poços internos para minimizar o potencial de gradientes térmicos através da placa e efeitos de borda da evaporação. Adicione 200 microlitros de água destilada estéril aos 36 poços externos e 150 microlitros nos espaços entre os poços. Em seguida, incubar a placa durante a noite a 37,5 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
No dia seguinte, realize a transfecção usando um total de 100 nanogramas de DNA. Configure quatro combinações diferentes de plasmídeos de acordo com as instruções do manuscrito. Utilizando 20 microliters de mídia essencial mínima modificada da Eagle tamponadas com HEPES, e 0,3 microliters de reagente de transfecção lipídica por poço.
Adicione 20 microliters de reagente de transfecção lipídica e mistura de DNA a cada poço, e misture a placa em círculos por 10 segundos. Incubar a placa a 37,5 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por seis horas. Refrescar o meio.
E incubar por mais 24 horas. Após a incubação, aspire o meio e adicione 100 microliters de mídia essencial modificada da Eagle tamponada com HEPES para cada poço. Deixe a placa estabilizar à temperatura ambiente por 10 minutos.
Enquanto isso, prepare o substrato de furimazina combinando um volume do substrato 100X com 19 volumes de tampão de diluição LCS, criando um estoque de 5X para misturar com o meio de cultura celular. Quando as células estiverem prontas, adicione 25 microliters do estoque a cada poço e misture suavemente a placa por 10 segundos. Em seguida, meça a luminescência por 10 minutos à temperatura ambiente para estabilização do sinal.
Para experimentos com adição de ligantes, prepare a solução de ligante 13,5X na mídia essencial mínima modificada da Eagle tamponada com HEPES, e adicione 10 microliters por poço usando uma pipeta multicanal. Em seguida, misture a placa à mão ou com um agitador orbital. Este protocolo tem sido usado com sucesso para estudar interações entre um GPCR prototípico e dois isoforms de beta-arrestina.
Quatro combinações plasmidas diferentes foram rastreadas, e a com o maior sinal luminescente foi selecionada para outros experimentos. Os valores EC50 para cada isoforma beta-detenção foram determinados por meio de curvas de dose-resposta, que foram obtidas a partir da resposta máxima de cada concentração de estudos cinéticos. É fundamental prestar atenção especial ao projetar os primers PCR.
O desenvolvimento das construções certas é essencial para o sucesso desses ensaios. Seguindo essa metodologia, você poderá monitorar as interações receptor-beta-prender, bem como interações receptoras com outras proteínas citosóicas. Essa metodologia ajudará a responder a perguntas fundamentais no campo da farmacologia GPCR, estudando como as interações GPCR-beta-arrestin podem ser moduladas por modificações na estrutura de ligantes.
