O isolamento de plastoglóbulos altamente puros é fundamental para o seu estudo. Um protocolo rápido e eficaz para o seu isolamento que facilita a sua investigação bioquímica a jusante é apresentado aqui. O principal benefício deste método é a velocidade relativa do procedimento e sua adaptabilidade a numerosas espécies de plantas e condições ambientais.
Cuidados especiais devem ser tomados ao sonicar as ressuspensões tilacóides para garantir força suficiente para retirar plastoglóbulos dos tilacóides e com a subsequente extração de plastoglóbulos do gradiente de sacarose. Demonstrando esse procedimento estarão o Dr. Elsinraju Devadasu, pesquisador de pós-doutorado em meu laboratório, e Febri Susanto, doutorando em meu laboratório. Comece adquirindo mudas de três semanas de idade de seis milhos saudáveis, com estágio de crescimento V5 e pesando aproximadamente 120 gramas.
Corte todas as folhas na base do caule e mergulhe-as rapidamente em um banho de gelo antes de transportá-las para a câmara fria. Trabalhando sob uma lâmpada de segurança verde, remova as folhas de milho do banho de gelo e corte-as em pedaços menores de cinco por cinco centímetros usando uma tesoura. Moer suave e completamente metade do tecido foliar cortado em 350 mililitros do tampão de moagem a um nível inferior a sete num liquidificador comercial.
Inicie e pare o liquidificador cinco a seis vezes para garantir que todas as folhas sejam cortadas. Filtre o homogeneizado através de uma camada de pano de nylon de 25 mícrons em um funil grande para quatro frascos de centrífuga de 250 mililitros. Depois de repetir a etapa de mistura com o restante tecido foliar cortado, divida uniformemente o filtrado entre os quatro frascos.
Retirar uma alíquota do filtrado foliar e reservá-la para ser armazenada como amostra total representativa das folhas. Em seguida, centrifugar o filtrado por seis minutos a 1, 840 G e quatro graus Celsius. Deitar fora o sobrenadante resultante e, com movimentos suaves de rodopio da escova, ressuspender o pellet em 12 mililitros de R 0,2 médio, contendo 0,2 de sacarose molar.
Depois de ressuspender o pellet em uma garrafa, adicione a suspensão à próxima garrafa e repita a ressuspensão para agrupar as suspensões em uma garrafa. Distribuir a suspensão agrupada entre seis tubos ultracentrífugos de três mililitros, atingindo um volume máximo de 2,5 mililitros em cada tubo. Em seguida, use o sonicator de ponta a uma amplitude de 100% para sonicar cada tubo quatro vezes por 10 segundos cada.
Certifique-se de manter o chifre do sonicador submerso e longe da superfície do líquido para evitar a formação de espuma. Mova lentamente a buzina do sonicator para cima e para baixo dentro da suspensão durante cada rodada. Ao alternar os quatro tubos, devolva cada tubo a um balde de gelo após cada sonicação para permitir que a amostra esfrie.
Uma vez feito, centrifugar a suspensão tilacóide bruta sonicated a 150.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Desnatar a superfície da almofada usando uma seringa e uma agulha de calibre 22 e colher a almofada flutuante amarela e oleosa resultante de plastoglóbulos brutos da almofada de sacarose. Recupere aproximadamente 500 microlitros de cada tubo e deposite-os em um tubo de 2,0 mililitros.
Colete alíquotas tilacóides brutas antes e depois da sonicação e liberação de plastoglobules. Uma vez feito, continue o processamento do tecido vegetal ou armazene os plastoglóbulos brutos a menos 80 graus Celsius e purifique-os mais tarde. Cultivar 50 mililitros de cultura da espécie synechocystis PCC 6802 em meio BG11 por 7 a 10 dias para atingir a fase estacionária.
Usando um espectrofotômetro, ajuste a densidade celular para uma densidade óptica de 2,0 a 750 nanômetros. Para remover os polissacarídeos, centrifugar 50 mililitros de cultura e remover o sobrenadante. Repita a lavagem das células em 50 mililitros de tampão A duas vezes.
Ressuspeite o pellet lavado em 25 mililitros de tampão A e quebre as células usando uma célula de pressão francesa a 1.100 libras de polegadas quadradas. Repita o processo três vezes em condições frias até que a cor lisada mude de verde para vermelho, azul, verde sob luz branca. Remova a alíquota do homogeneizado celular e reserve-a para ser armazenada como uma amostra de célula total representativa.
Distribuir o homogeneizado resultante em oito tubos de ultracentrífuga de três mililitros cheios até um máximo de 2,5 mililitros em cada tubo. Sobreponha este homogeneizado com 400 microlitros de R médio, produzindo um gradiente de degraus. Equilibre cuidadosamente os tubos adicionando o meio R adicional, conforme necessário, antes de centrifugar os tubos.
O tilacóide e outras organelas mais pesadas, incluindo quaisquer corpos de polihidroxialcanoato, mostram formação de pelotas, enquanto os plastoglóbulos formam uma almofada oleosa amarela sobre ou perto do topo do gradiente de sacarose. Colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos brutos com uma seringa, como demonstrado anteriormente, e deposite a colheita em um tubo de dois mililitros. Raspe os plastoglóbulos do lado da parede do tubo de ultracentrífuga com uma ponta de agulha, se necessário.
Ou continuar com o processamento de cianobactérias ou armazenar plastoglóbulos brutos a menos 80 graus Celsius e purificar mais tarde. Para colher os plastoglóbulos puros usando o método de processamento de tecido vegetal, prepare o gradiente de sacarose descrito anteriormente usando 500 microlitros de plastoglóbulos brutos, 400 microlitros de meio R 0,2 e 400 microlitros de médio R.Após centrifugação, colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos puros em um tubo de dois mililitros. Depois de alicitar os plastoglóbulos puros e congelar as alíquotas em nitrogênio líquido, armazene-as a menos 80 graus Celsius ou liafilize-as em um pó seco.
Para colher plastoglóbulos puros de cianobactérias, crie um gradiente de sacarose, como mencionado anteriormente, usando 500 microlitros dos plastoglóbulos brutos, 750 microlitros do meio R 0,7 e 750 microlitros do meio R 0,2. Após a centrifugação, colete os plastoglóbulos puros em um tubo de 1,5 mililitro e alíquota os plastoglóbulos puros. Uma vez feito, congele rapidamente as alíquotas de plastoglóbulos puros em nitrogênio líquido e armazene-as diretamente a menos 80 graus Celsius ou liofilize em um pó seco.
Neste método, uma quantidade significativa de plastoglobule ou material de gotículas lipídicas foi vista flutuando na camada superior da almofada de sacarose. Após a centrifugação subsequente, plastoglóbulos purificados foram obtidos na superfície ou perto da superfície do gradiente de sacarose. Após o isolamento bem-sucedido dos plastoglobules, imunoblots desenvolvidos para avaliação de pureza utilizando anticorpos levantados contra arabidopsis thaliana fibrillin 1a e arabidopsis thaliana photosystem II subunidade D1 mostraram que os homólogos da fibrilina estavam primariamente associados a tilacóides do que os plastoglobules.
Para garantir a extração eficiente e concentrada da almofada flutuante, coloque o orifício da agulha da seringa logo abaixo da superfície líquida do tampão enquanto estiver completamente submerso e, em seguida, puxe suavemente para cima. Amostras isoladas de plastoglobule são passíveis de estudos proteômicos ou lipidômicos subsequentes e têm sido usadas para demonstrar as mudanças na composição proteico-lipídica alvo sob diferentes condições ambientais. Esta técnica facilitou novos estudos do plastoglobule, incluindo a descoberta da atividade da proteína quinase associada e a presença de complexos proteicos oligoméricos através de investigação bioquímica subsequente.
