A principal vantagem dessa técnica é que ela permite distinguir proteínas de atividades semelhantes que têm diferentes funções, dependendo da localização em membranas envelope, estroma ou thylakoid. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão, porque usarão plantas muito velhas, misturem a folha por muito tempo, ou não terão cuidado o suficiente ao suspender as pelotas de cloroplasto intacto, mas frágil. A demonstração visual deste método é fundamental, pois o carregamento ou a recuperação de fração de percoll ou em passos gradientes de sacarose são difíceis de aprender.
Devido ao risco de mistura dos gradientes e, portanto, de contaminar cruzadamente as várias sub frações de cloroplasto. Demonstrar o procedimento será de Imen Bouchnak, um estudante de doutorado do nosso laboratório e Lucas Moyet, um engenheiro interno. Para começar, plante arabidopsis por cinco semanas com um ciclo de luz de 12 horas a 23 graus Celsius durante o dia e 18 graus Celsius durante a noite, com uma intensidade leve de 150 micromoler por metro quadrado por segundo.
No dia seguinte, pré-pesar um béquer de cinco litros e, em seguida, colocá-lo no gelo. Colher as folhas arabidopsis, certificando-se de evitar colher qualquer solo. Repesar o béquer e registrar o peso do tecido.
Transfira as folhas colhidas para uma sala fria. Coloque as folhas em um liquidificador contendo dois litros de tampão de moagem e homogeneize-as misturando-as em alta velocidade três vezes durante uma duração de dois segundos cada vez. Coloque quatro camadas de musselina e uma camada de tex azul de nylon em um coador e isso para filtrar o homogeneizar.
Aperte suavemente as folhas misturadas dentro da musselina e tex azul para extrair todo o líquido. Recupere o tecido restante no copo do liquidificador e repita o processo de homogeneização usando um tampão de moagem fresco. Use de quatro a cinco camadas de nova musselina para filtrar este novo homogeneizar em um novo béquer como descrito anteriormente.
Distribua o extrato de célula bruta igualmente em seis garrafas de 500 mililitros. Coloque as garrafas no gelo. Centrifugar as garrafas geladas a 2070 G e quatro graus Celsius por dois minutos.
Depois disso, descarte suavemente o supernaspe. Use uma bomba de água para aspirar qualquer supernascedor restante e mantenha as pelotas, que contêm cloroplasto bruto concentrado, no gelo. Usando uma pipeta de 10 mililitros, adicione três mililitros de meio de lavagem a cada garrafa, certificando-se de não usar pontas finas de pipeta para evitar quebrar os cloroplastos.
Em seguida, use uma escova de tinta ou espátula de plástico curva para suspender suavemente as pelotas. Usando uma pipeta de 10 mililitros, colete os cloroplastos re-suspensos em um único tubo. Inverter suavemente o tubo para obter uma suspensão homogênea de cloroplasto.
Para começar, use uma pipeta de 10 mililitros para carregar lentamente seis mililitros da suspensão do cloroplasto em cima de cada um dos seis gradientes percoll preparados. Usando um rotor de balde balançando, centrifugar os gradientes a 13,300 G e quatro graus Celsius por 10 minutos. Use uma bomba de água para aspirar a fase superior, que contém cloroplastos quebrados e mitocôndrias intactas.
Em seguida, use uma pipeta de 10 mililitros para recuperar cloroplastos intactos presentes na fase inferior, tomando cuidado para não aspirar os núcleos e detritos celulares encontrados na parte inferior do tubo, juntamente com os cloroplastos intactos. Diluir a suspensão de cloroplasto intacto de três a quatro vezes com meio de lavagem. Mantenha aproximadamente 10 mililitros de uma alíquota de fração de cloroplasto intacto para análise suplementar por SDS-Page e mancha ocidental.
Centrífuga a 2070 G e 4 graus Celsius por dois minutos. Depois disso, descarte suavemente o supernaspe. Use uma bomba de água para aspirar qualquer supernascedor restante e mantenha a pelota, que contém cloroplastos brutos concentrados, no gelo.
Para lise os cloroplastos intactos purificados, suspenda a pelota em meio hipotônico que contém inibidores de protease. Transfira os cloroplastos re-suspensos para um tubo falcão de 10 mililitros. Prepare o gradiente de sacarose conforme descrito no protocolo de texto.
Usando uma bomba peristáltica, carregue lentamente três mililitros dos cloroplastos líseos em cima de cada um dos gradientes de sacarose pré-formados. Use tampão médio hipotônico para equilibrar pares de tubos e, em seguida, ultracentrífugue o gradiente a 70.000 G e quatro graus Celsius por uma hora. Tome uma alíquota das proteínas estromas solúveis para serem usadas na determinação da concentração proteica.
Em seguida, use uma bomba de água para aspirar a fase superior restante do gradiente até a faixa amarela. Usando uma pipeta, recupere a faixa amarela, que é o envelope. Puxe os envelopes em um tubo.
Em seguida, remova a fase restante do gradiente até a pelota de tirokoide. Suspenda-as as cápsulas de tiroakoide no tampão de lavagem de membrana com inibidores de protease. Diluir a suspensão de tirocoida e envolvê-la de três a quatro vezes com meio de lavagem, ajustando o volume final para 10 mililitros.
Equilibre pares de tubos com tampão de lavagem de membrana e ultra-centrífugas a 110.000 G e quatro graus Celsius por uma hora. Depois disso, use uma bomba d'água para aspirar cuidadosamente o supernaspe. Adicione aproximadamente 100 microliters de tampão de lavagem de membrana à pelota do envelope.
Em seguida, aspire o supernatante do tubo de tirokoide. Suspenda as cápsulas de tirokoide em três mililitros de tampão de lavagem de membrana. Armazene os três subpartidamentos purificados em nitrogênio líquido para uso em outros experimentos.
Depois que as frações de membrana são recuperadas, lavadas e concentradas, a SDS-Page é usada para quantificar as proteínas e analisar a composição de todas as quatro frações. A proteína mais abundante do estroma é a RBCL, e resultados representativos mostram o resultado esperado, que muito pouco da grande subunidade desta proteína está contida nas frações de timilakoide e membrana envelope. As proteínas complexas de colheita leve são abundantes componentes de tirocoide que mal devem contaminar as membranas do envelope.
Por fim, o translocador de fosfato triose fosfato só é visível na fração do envelope purificado, devido ao seu forte enriquecimento na fração do envelope quando comparado com os extratos inteiros de cloroplasto. A contaminação cruzada dos três subcompartidamentos, a reductoisomerase solúvel de cetol-ácido do estroma, o envelope de cloroplasto atpase de cobre e as proteínas complexas de colheita de luz das membranas thylakoidas podem ser quantificadas usando tanto a análise de imunobloquetação quanto a espectrometria de massa. Embora o estroma não seja geralmente contaminado por frações de envelope ou thylakoide, as frações purificadas do envelope contêm 3% de proteínas de timkoóide e até 10% de proteínas do estroma.
Os tilakoides são mal contaminados por proteínas do estroma, mas contêm até 3% das proteínas de membrana envelope. Os cloroplastos desempenham muitas funções cruciais, como assimilação de carbono, enxofre e nitrogênio, bem como a síntese de metabólitos essenciais. A fim de decifrar novos mecanismos regulatórios que controlam a fisiologia do cloroplasto, definir a localização da surplastia das proteínas cloroplastas é fundamental para estudos super-direcionados.
Cloroplastos contêm vários subcompartidários. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do cloroplasto, como onde a proteína de cloroplasto específico está localizada dentro da organela. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de conduzir todas as etapas de isolamento de cloroplasto a quatro graus para remitar a protea em frações purificadas.
Após este procedimento, outros métodos como abordagens proteômicas lascare podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais como a composição e dinâmica do proteome dos valores subpartidesplóides. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da fisiologia vegetal explorarem muitos aspectos diferentes da biogênese e função do cloroplasto utilizando a análise direcionada das proteínas candidatas identificadas dentro dos subcompartidamentos plastídeos. Não se esqueça que trabalhar com liquidificador de volume, nitrogênio líquido, em compostos específicos como inibidores de protease, requer cuidados especiais.
Precauções como o uso de luvas, jaleco e óculos de segurança devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
