Este protocolo permite a diferenciação eficiente e reprodutível de adipócitos marrons que expressam os principais fatores de transcrição adipogênicos, marcadores de adipócitos maduros e têm potencial termogênico e fenótipo morfológico de adipócitos marrons maduros. Este é um procedimento de diferenciação bifásica simples e replicável para obter células com características de adipócitos marrons maduros a partir de tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos. Este protocolo permite estudar os mecanismos de ativação do tecido adiposo marrom como alvo para o tratamento da obesidade.
Tem sido um modelo para determinar os mecanismos envolvidos na fisiopatologia da lipodistrofia. Espera-se que a execução dessa técnica pela primeira vez seja um desafio. É essencial ter um protocolo detalhado e enfatizar pontos críticos para ter resultados bem-sucedidos.
Para começar, coloque o camundongo sacrificado em decúbito ventral e faça uma incisão na pele de um centímetro de comprimento no nível médio das costas do animal usando uma tesoura afiada. Remova a pele com cuidado, retire cirurgicamente o iBAT da carcaça usando uma tesoura pequena. Colha os dois lóbulos do iBAT usando um alicate de ponta curva para remover os lóbulos de forma independente.
Coloque os dois lóbulos em um tubo de plástico com 1,5 mililitros de PBS estéril em temperatura ambiente. Incubar os tecidos do iBAT em tampão de digestão colagenase tipo dois por 45 minutos a 37 graus Celsius com agitação suave contínua a 800 RPM. Interrompa mecanicamente a suspensão tecidual no tampão de digestão colagenase tipo dois, pipetando para cima e para baixo usando uma micropipeta P1000 e pontas de filtro.
Use uma nova ponta para cada amostra. Passe os tecidos dessegregados através de filtros de células individuais de 100 micrômetros para novos tubos de 1,5 mililitro. Adicione 500 microlitros de tampão ACK às amostras de tecido filtrado.
Inverter os tubos quatro a cinco vezes e incubar à temperatura ambiente durante quatro minutos. Em seguida, passe as suspensões por um filtro de células de 40 micrômetros em novos tubos de 1,5 mililitro usando uma micropipeta P1000 e pontas filtradas. Centrifusion ressuspende o pellet conforme descrito no manuscrito do texto.
Em seguida, semeie cada amostra em seis poços de uma placa de cultura de 24 poços, adicionando um mililitro da suspensão a cada poço. Os pré-adipócitos indiferenciados apresentaram níveis muito baixos ou indetectáveis de ppar-gama, C/ebp-alfa, perilipina 1 e CD36. Em contraste, esses marcadores foram significativamente maiores no sétimo dia de diferenciação.
O acúmulo de múltiplas gotículas lipídicas nos pré-adipócitos marrons foi consistente com os resultados publicados anteriormente. Um aumento significativo foi observado nos níveis de proteína do marcador de massa mitocondrial TOM 20 e do complexo de fosforilação oxidativa no sétimo dia de diferenciação. UCP1, um marcador genuíno deste tipo de célula, não foi detectado em pré-adipócitos indiferenciados, enquanto foi substancialmente expresso em adipócitos marrons maduros no sétimo dia de diferenciação.
As mitocôndrias evoluíram de uma forma tubular alongada no dia zero para uma forma arredondada ou semelhante a um feijão no dia sete. A estrutura interna mitocondrial também foi modificada pela adipogênese, resultando em maior densidade dos cristais compactados paralelamente. É importante ressaltar que as mitocôndrias estavam intimamente associadas a gotículas lipídicas nos adipócitos marrons diferenciados, de modo que nenhuma distância discernível entre a membrana externa da mitocôndria e as superfícies das gotículas lipídicas pôde ser detectada, mesmo com microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução.
A remoção cirúrgica do tecido adiposo interescapular é crítica. Uma quantidade ineficiente de tecido limita a disponibilidade de células que serão diferenciadas. Esta técnica de imagem ajuda a caracterizar a morfologia de adipócitos marrons diferenciados in vitro.
É possível realizar ensaios para função mitocondrial, ativação beta androgênica e inibição autofágica.
