Este protocolo descreve a geração de camundongos do Sistema Imunológico Humano, ou HIS, para estudos pré-clínicos de imuno-oncologia. Os modelos de câncer de camundongo são limitados em sua diversidade e se traduzem mal para a clínica. Esta técnica serve como um modelo pré-clínico para estudos de imunoterapia, avaliando o tratamento de tumores humanos em um camundongo com sistema imunológico humano.
O modelo de camundongo humanizado pode ser usado para estudar vários aspectos da imunologia humana, incluindo respostas a muitas infecções ou cânceres do sistema imunológico humano. Adquirir uma fonte confiável e robusta de sangue do cordão umbilical e manter a saúde da colônia de camundongos imunodeficientes pode ser um desafio. Conhecimentos especializados em citometria de fluxo e análise imunológica são essenciais.
Quem demonstrará o procedimento será Kristina Larsen, uma profissional de serviços de pesquisa do meu laboratório. Para começar, ressuspenda a pastilha de células CD34-positivas isoladas do sangue do cordão umbilical em 300 microlitros de tampão separador de célula magnética por uma vez 10 até a oitava célula. Adicionar 100 microlitros de reagente bloqueador de FCR por uma vez 10 às oitava células, seguido por 100 microlitros de esferas magnéticas CD34-positivas por uma vez 10 às oitavas células, e incubar a quatro graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, adicione cinco mililitros de tampão separador de célula magnética por uma vez 10 às oitavas células e gire a 360 g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Repita a etapa de lavagem e ressuspenda o pellet em 500 microlitros por 100 milhões de células de tampão separador de células magnéticas em um tubo cônico de 15 mililitros marcado como não fracionado. Rotule mais dois tubos de 15 mililitros CD34-negativo e CD34-positivo Coloque os três tubos em um rack de resfriamento.
Separe as células usando o programa de seleção positiva de duas colunas em um separador automático de células magnéticas em um gabinete de biossegurança. Em seguida, para expandir e congelar células-tronco humanas CD34-positivas, prepare o sangue do cordão umbilical, ou meio CB, conforme descrito no manuscrito, e passe por um filtro de 0,22 mícron. Ressuspender as células CD34-positivas a 100.000 por mililitro de meio CB e incubar a 37 graus Celsius.
No terceiro dia, adicionar ao balão um volume igual de meio CB sem citocinas. No quinto dia, colher as células CD34-positivas expandidas. Pipetar a suspensão da célula para cima e para baixo e coletar em um tubo cônico de 50 mililitros.
Adicionar um meio CB suficiente para cobrir o fundo do balão. Usando um raspador de células, raspe todo o fundo do frasco. Colete todos os meios no mesmo tubo de 50 mililitros e centrífugo.
Ressuspender as células em dois mililitros de meio CB e centrifugar. Aspirar o meio até o pellet e ressuspendê-lo em meio de congelamento. Em seguida, inicie a preparação de células CD34-positivas três horas após a irradiação do filhote.
Aqueça 10 mililitros de mídia CB em um tubo de 50 mililitros. Recupere um frasco de células CD34-positivas expandidas e congeladas in vitro para cada quatro a seis filhotes a injetar. Descongele rapidamente a 50 a 55 graus Celsius até que apenas uma pequena quantidade de gelo seja visível, e adicione as células ao meio CB aquecido.
Use um mililitro de meio para enxaguar cada frasco e gire as células a 360 g por 12 minutos a quatro graus Celsius. Aspirar o meio cuidadosamente. Ressuspender o pellet em dois mililitros de meio CB e contar as células.
Novamente, centrifugar as células, aspirar o meio e ressuspender o pellet em 100 microlitros de PBS estéril por n mais um filhote para injetar, resultando em 250.000 a 450.000 células CD34-positivas por camundongo. Para o isolamento PBMC do sangue de camundongos, misture a heparina sanguínea pipetando suavemente para cima e para baixo e sobreponha lentamente em cima de 500 microlitros de gradiente de densidade de 1,077 grama por mililitro, tomando cuidado para não perturbar a interface. Centrifugar o tubo a 1, 220 g durante 20 minutos à temperatura ambiente sem pausas.
Remova o maior número possível de células do buffy coat com uma pipeta de 200 microlitros e adicione ao novo tubo de 1,5 mililitro contendo 750 microlitros de meio de colheita. Centrifugar a 360 g por 11 minutos. Aspirar o meio para 50 microlitros, e ressuspender o pellet em 750 microlitros de meio de colheita.
Adquira os dados de 100 microlitros de cada amostra em um citômetro de fluxo. Em seguida, importe o arquivo fcs para o software de edição de dados de fluxo e aplique uma porta de polígono a um gráfico FSC-A versus SSC-A. Mude os eixos para FSC-A versus FSC-H e abra as células na diagonal linear, excluindo os duplos que se projetam da linha.
Selecione essas células e altere os eixos para hCD45 versus mCD45. Aplique uma porta de polígono à população hCD45-positiva e aplique o nome humano. Aplique uma porta de polígono à população mCD45-positiva e aplique o nome mouse.
Crie uma estatística de contagem para populações humanas e de camundongos. Em seguida, selecione a população humana e altere os eixos para CD19 versus CD3. Aplique uma porta de polígono às células CD19-positivas e nomeie-as células B.
Aplique uma porta de polígono à população CD3-positiva e nomeie-a de células T. Em seguida, aplique uma porta de polígono à população duplamente negativa e nomeie-a como não-TB. Selecione a população de células T e altere os eixos para CD4 versus CD3.
Aplique uma porta de polígono à população CD4-positiva e nomeie-a CD4-positiva. Aplique uma porta de polígono à população CD4-negativa e nomeie-a CD8. Selecione a população sem TB e altere os eixos para CD56 versus mielóide.
Aplique uma porta de polígono à população total CD56-positiva e nomeie-a como células NK. Em seguida, aplique uma porta poligonal à população CD56-negativa e mielóide-positiva, e nomeie-a mieloide. Crie uma tabela para as estatísticas de porcentagem e contagem de todas as populações e exporte-a para uma planilha.
Calcule a porcentagem de quimerismo hCD45 usando a fórmula indicada. Depois de cultivar células tumorais no camundongo e administrar tratamentos medicamentosos, colete os tecidos. Coloque o mouse em uma placa de dissecção de espuma com pinos para mantê-los no lugar e os braços e pernas estendidos a 45 graus.
Faça uma incisão até o meio do tronco, começando perto da pelve e estendendo-se até o queixo. Puxe a pele até a borda e segure-a no lugar com alfinetes. Extrair os gânglios linfáticos usando pinças finas na ordem axilar, cervical, mesentérica, inguinal e hiatal.
Coloque os gânglios linfáticos de um lado da lâmina de vidro fosco em uma placa de Petri em oito mililitros de meio de colheita. Segurando as lâminas em ângulos perpendiculares com as bordas foscas para dentro, pressione suavemente os tecidos até que o conteúdo celular seja liberado. Enxágue a lâmina várias vezes, separando-as e juntas para liberar o número máximo de células.
Colete as células com uma pipeta de vidro de cinco polegadas e filtre-as através de uma pipeta de algodão de nove polegadas em um tubo cônico de 15 mililitros rotulado. Em seguida, extrair o tumor do flanco aberto segurando o tumor com pinça enquanto corta lentamente as margens do tumor com tesoura de dissecção. Pesar o tumor e remover 1/4 do tumor para processamento de RNA e imunohistoquímica.
Coloque os 3/4 restantes do tumor em um prato de seis centímetros e pique em pedaços de um milímetro usando uma lâmina de bisturi. Transfira os pedaços do tumor para um tubo de dissociação. Em seguida, enxágue o prato com meio TIL incompleto e adicione-o ao tubo.
Adicionar a preparação de colagenase e dissociar o tecido usando dissociação mecânica a 37 graus Celsius por 30 minutos a uma hora. Passe a suspensão sobre um filtro de 100 mícrons para um tubo cônico de 50 mililitros e lave o filtro com 10 mililitros de mídia completa TIL. Centrifugar e ressuspender o pellet em meio de colheita suficiente com DNase, para que a suspensão de células possa passar facilmente por uma ponta de pipeta P1000 e registrar o volume para análise a jusante.
No PDX CRC 307P, o tratamento combinado retardou o crescimento do tumor, conforme determinado pelo volume de crescimento tumoral ao longo do tempo, pesos tumorais e taxa de crescimento específica. PDX CRC 307M testado em uma coorte diferente de camundongos foi menos afetado pelo mesmo tratamento combinado em camundongos HIS BRGS. Com base no quimerismo geral hCD45-positivo e hCD3-positivo de células T humanas no sangue antes da implantação do tumor, ambos os parâmetros aumentaram no sistema imunológico periférico e no TIL em combinação com camundongos portadores de CCR 307P tratados, mas não no modelo CRC 307M.
A investigação das células T humanas revelou mais células T ativadas nos tumores CRC 307P, mas não na linfa de camundongos tratados combinadamente. Além disso, houve mais células T CD8-positivas de memória efetoras e menos células T positivas para TIM-3 nos tumores CRC 307P tratados combinadamente. Em contrapartida, essa diferença não foi observada no modelo CRC 307M.
Além disso, não foram observadas mudanças nas frequências das populações de células T citotóxicas entre os camundongos tratados com combinação, embora células T citotóxicas mais altas tenham sido observadas em camundongos não tratados. O tratamento combinado não afetou as frequências de Tregs em órgãos linfáticos ou tumores do CCR 307P, embora os dados do CCR 307M tenham mostrado uma tendência de redução de Tregs. Alterações relacionadas à imunidade nas células tumorais foram elevadas por citometria de fluxo.
Aumento da expressão de MHC classe I e classe II foi observado nas células tumorais CRC 307P excisadas de camundongos HIS BRGS tratados com combinação. No modelo CRC 307M, o mesmo tratamento medicamentoso induziu a expressão de HLA classe II nas células tumorais. Da mesma forma, o tratamento combinado resultou em aumento da expressão de PD-L1 nas células tumorais CRC 307P positivas para EpCAM.
Finalmente, foram investigadas correlações das respostas imunes com o crescimento tumoral. O aumento de células T CD4-positivas mostrou uma correlação significativa com menor crescimento tumoral e, mais especificamente, com células T ativadas positivas para HLA-DR nos camundongos HIS tratados com combinação. Técnica estéril ao isolar as células CD34-positivas, pois os camundongos são extremamente imunodeficientes.
O quimerismo resultante é variável dentro e entre doadores de sangue de cordão umbilical, e as células T têm a maior variação. Combinações ilimitadas de imunoterapia podem ser realizadas, bem como estudos mecanísticos e cinéticos de dosagem de drogas, por exemplo, deleção de células T CD8 para confirmar seu papel. É importante ressaltar que as toxicidades relacionadas a drogas também podem ser estudadas.
Ele forneceu um modelo pré-clínico mais relevante e acessível para testar imunoterapias humanas para tradução para a clínica. Vários ensaios clínicos estão em andamento agora com base nesses dados.
