0.Nosso protocolo descreve um método otimizado e reprodutível para gerar osteoclastos in vitro que pode ser usado para investigar os mecanismos subjacentes ao seu processo de diferenciação e funcionalidade. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de gerar um alto número de osteoclastos funcionalmente ativos em apenas uma semana. Um alto rendimento de diferenciação é obtido usando monócitos purificados e adicionando citocinas a tempo.
Os osteoclastos são responsáveis pela destruição óssea em todas as formas de artrite, e este método fornece as ferramentas para selecionar novos compostos terapêuticos que podem modular sua diferenciação e/ou funções. Quem demonstrará o procedimento será Patricia Riedlova, aluna de doutorado do nosso laboratório. Para começar, isole as PBMCs transferindo o sangue para um novo tubo de 50 mililitros.
Diluir com PBS estéril em volume igual para sangue fresco ou proporção de 1:3 para cones de leucócitos e pelagens bufantes. Misture suavemente o sangue por inversão. Prepare tubos de 15 mililitros contendo três mililitros de meio de gradiente de densidade e coloque lentamente de oito a 10 mililitros de sangue diluído no topo do meio de gradiente de densidade, evitando misturar.
Centrifugar o tubo a 400 x g durante 30 minutos à temperatura ambiente sem travão. Em seguida, descarte cuidadosamente a camada superior com uma pipeta Pasteur. Colete a camada de interfase abaixo que contém os PBMCs e transfira essa camada para um novo tubo de 50 mililitros.
Suspender as células até 50 mililitros com PBS estéril e lavar o meio de gradiente de densidade residual centrifugando a 300 x g por 10 minutos à temperatura ambiente com freio completo. Para remover as plaquetas residuais, repita o processo de centrifugação descrito no manuscrito, ressuspenda as CMSP isoladas e purificadas em 20 mililitros de PBS e conte-as usando um hemacitômetro seguindo o método padrão. Para enriquecer os monócitos CD14+, transfira 1 x 10 para o sétimo PBMCs em um tubo de fundo redondo de poliestireno adequado e peletize as células a 300 x g por cinco minutos.
Após descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em tampão de separação celular, incubar as células com 10 microlitros de coquetel de anticorpos por 100 microlitros com a tampa ligada por 10 minutos. Ao final da incubação, adicionar 10 microlitros das esferas de nanopartículas magnéticas por 100 microlitros e incubar por três minutos com a tampa ligada. Aumente o volume para 2,5 mililitros com o tampão de separação celular.
Coloque o tubo em um ímã e incube por três minutos com a tampa desligada. Agora, descarte a população de células negativas com um movimento contínuo por inversão enquanto o tubo ainda está no ímã. Retire o tubo do ímã, lave os monócitos CD14+ enriquecidos ligados às esferas magnéticas, ressuspendendo-os em 2,5 mililitros do tampão de suspensão da célula e coloque o tubo de volta no ímã.
Conte as células isoladas conforme demonstrado anteriormente. Centrifugar as células coletadas a 300 x g por cinco minutos. Após descartar o sobrenadante, ressuspenda as células a 1 milhão de células por mililitro em meio essencial alfa mínimo completo com 10% de FBS.
Para diferenciar o osteoclasto, adicione M-CSF em uma concentração final de 25 nanogramas por mililitro à suspensão celular e misture pipetando completamente para homogeneizar a suspensão celular. Placa de 100 microlitros da suspensão por poço em uma placa de fundo plano de 96 poços. Em seguida, adicione 200 microlitros de água destilada estéril por poço ao redor das células chapeadas para evitar evaporação do meio e efeitos de borda no sistema de cultura.
Incubar as células durante a noite por aproximadamente 18 a 20 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Preparar meios frescos suplementados com M-CSF e ligante RANK. Após a incubação, remova cuidadosamente metade do meio por aspiração usando uma pipeta P200 e substitua-o por meio completo fresco e quente suplementado com M-CSF e ligante RANK em uma concentração final de 25 nanogramas por mililitro.
Diferenciar as células em osteoclastos por sete a 14 dias com substituição completa do meio a cada três dias. Após a remoção do meio, fixar os osteoclastos aderentes diferenciados com 100 microlitros por poço da solução fixadora preparada e incubar por um minuto. Não toque no fundo dos poços para evitar arranhar as células aderentes.
Depois que os poços forem lavados três vezes com 300 microlitros de água destilada estéril, seque as placas e adicione 100 microlitros de solução corante recém-preparada a cada poço. Incubar a placa a 37 graus Celsius no escuro por 20 minutos. Após a incubação, remova a solução corante por inversão e lave a placa três vezes com 300 microlitros por poço de água destilada.
Retire o excesso de água batendo os pratos em papel toalha e deixe os pratos abertos e protegidos da luz para secar ao ar durante a noite. Usando um microscópio de campo claro com uma opção de telha, tire imagens em 10x ou 20x para capturar toda a superfície do poço. Conte manualmente os osteoclastos identificados como células coradas com TRAP+roxo com mais de três núcleos usando um software de análise de imagem com um plugin de contador de células.
Placa de 100 microlitros dos monócitos CD14+ isolados por poço em uma lâmina de câmara de 18 poços a uma densidade celular de 1 x 10 até a quinta célula por poço. Diferenciar os osteoclastos na presença do ligante M-CSF e RANK, conforme demonstrado anteriormente, com troca completa de meio a cada três dias. No ponto final, remova suavemente o meio e lave cada poço duas vezes com 200 microlitros de PBS pré-aquecido em pH 7,4.
Não deixe os poços secarem entre as etapas. Fixar a amostra com 100 microlitros por poço de solução de formaldeído a 4% em PBS e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente num agitador orbital com agitação suave. Após a incubação, lavar as células duas vezes com 200 microlitros por poço de PBS.
Permeabilizar as células com 100 microlitros por poço de solução de Triton x-100 a 0,1% diluída em PBS e incubar por 10 minutos, como mostrado anteriormente. Lave duas vezes com 200 microlitros por poço de PBS. Para bloquear a ligação inespecífica e aumentar o sinal, adicione 100 microlitros de solução de bloqueio feita com albumina de soro bovino a 2% e solução de PBS.
Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente num agitador orbital com agitação suave. Depois de remover a solução de bloqueio, adicionar 100 microlitros de solução de faloidina conjugada fluorescentemente diluída em solução de BSA/PBS a 2% em cada poço. Lave duas vezes com 200 microlitros por poço de PBS.
Corar os núcleos com 100 microlitros por poço de uma solução de PBS contendo 300 nanomolares DAPI. Após 10 a 15 minutos, remova a solução DAPI e substitua-a por PBS de 100 microlitros por poço. Visualize a coloração usando imunofluorescência apropriada ou microscópios confocais de quatro a 40x.
Os osteoclastos maduros são definidos como TRAP+células nucleadas múltiplas. A adição do ligante RANK produziu um número crescente de grandes osteoclastos TRAP+multinucleados de forma dose-dependente. A cinética de diferenciação dos osteoclastos a partir de monócitos foi investigada durante um período de cultura de dois a 14 dias.
Os osteoclastos multinucleados foram visíveis a partir do quinto dia, e a diferenciação ideal foi alcançada no sétimo dia. A diferenciação de osteoclastos em superfícies mineralizadas permite avaliar sua atividade de reabsorção através da análise da formação de orifícios redondos, ou fossas de reabsorção. A porcentagem de reabsorção aumenta significativamente na presença do ligante M-CSF e RANK quando comparado ao M-CSF isoladamente.
Além disso, o tratamento com rotenona dose-dependente inibiu a reabsorção da superfície mineralizada em comparação com o poço controle não tratado. A inibição da reabsorção de osteoclastos dependente de rotenona foi associada à inibição da produção de ATP. A fragmentação do anel de actina derivado do ligante RANK do OCS maduro foi observada na presença de rotenona.
É importante garantir que os monócitos enriquecidos não contenham plaquetas, que as células sejam plaqueadas na densidade certa e que os poços circundantes sejam preenchidos com água para evitar o efeito de borda. Este protocolo é particularmente útil para interrogar mecanisticamente como os osteoclastos se formam e o que influencia sua funcionalidade tanto na ciência básica quanto na translacional. Por exemplo, usando compostos ou proteínas que podem modular esses processos.
