Neste protocolo, as células monócito-macrófago da medula óssea são extraídas pelo método de adesão secundária. As células monófato-macrófagos da medula óssea podem se diferenciar com sucesso em osteoclastas, o que fornece um modelo celular estável para o estudo de osteoclatos in vitro. Este método é adequado para pequenas amostras de medula óssea e pode extrair células monócito-macrófagos de medula óssea de medula óssea de forma simples e rápida sem exigir equipamentos de laboratório de alta tecnologia.
O aumento dos osteoclatos pode ser a potencial patogênese da osteoporose. As células monófato-macrófagos da medula óssea têm certo valor de pesquisa como células precursoras do osteoclast. Para começar, mergulhe os ratos eutanizados em 75% de álcool por 10 minutos para desinfecção.
Depois de remover cuidadosamente todos os membros do rato com tesouras e fórceps, aspire com PBS usando uma pipeta e lave o sangue aderindo aos membros. Em seguida, em dois mililitros do DMEM 10%FBS em um tubo de cinco mililitros. Depois de transferir os ossos do membro para o tubo de cinco mililitros, use uma tesoura para cortar os ossos do membro no tubo em pequenos pedaços e misturar o homogenate para resuspensar as células de medula óssea no meio da cultura.
Fique por cinco minutos até que os fragmentos de tecido se instalem na parte inferior do tubo. Em seguida, adicione 10 mililitros de 10%FBS DMEM em um prato de cultura de 100 milímetros, e, em seguida, transfira o supernascedor para o prato de cultura. Incubar a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por aproximadamente 24 horas.
Após esse período de incubação, a maioria das células-tronco mesenquimais aderirão à parede de pratos da cultura e crescerão lentamente, enquanto a maioria das células monocito-macrófago da medula óssea ainda será suspensa no meio da cultura. Transfira a suspensão celular no prato de cultura de 100 milímetros para um novo frasco quadrado de 25 centímetros e continue a cultivar as células a 37 graus Celsius em dióxido de carbono de 5% por mais 24 horas. Depois de remover o meio antigo cuidadosamente, substitua-se por meio fresco após as células monócito-macrófago da medula óssea terem aderido à parede do frasco.
A citometria de fluxo mostrou que a porcentagem de células expressando CD11b e c, um marcador molecular na superfície das células de linhagem monocito-macrófago foi de aproximadamente 37,94%Com a contínua proliferação celular, a maioria das células se tornou maior dentro da forma irregular e cresceu em um disco aderente radial. Os resultados da mancha TRAP mostraram que, em comparação com o grupo controle, o número de grânulos vermelhos roxos intracelulares foi significativamente aumentado em células induzidas com ativador receptor de fator nuclear kappa B ligante e fator estimulante da colônia de macrófagos. A análise da mancha ocidental demonstrou que os níveis de expressão das proteínas específicas do osteoclato TRAP e cathepsina K foram significativamente aumentados nas células tratadas em comparação com o grupo controle.
O mais importante neste procedimento é o tempo de coletar células aderentes secundárias em 24 a 48 horas de cultura primária, as células monocito-macrófago da medula óssea começam a aderir completamente. As células monócito-macrófagos da medula óssea isoladas por este método podem ser induzidas em osteoclasta in vitro, fornecendo um modelo celular estável para o estudo da osteoporose.
