Este ensaio de sedimentação in vitro baseado em concanavalina A foi projetado para medir a afinidade de ligação das fosfatases glucanas contra diferentes substratos STA. As informações que obtemos deste método são fundamentais para o entendimento da família de enzimas glucanas fosfatases. As interações de proteínas de carboidratos são relativamente fracas, portanto, os métodos atuais não podem detectar interações glucana fosfatase e glucana.
Nosso ensaio de cossedimentação baseado em lectina pode detectar afinidade de ligação na faixa milimolar. A caracterização dos mutantes SEX4, bem como de outros membros da família de enzimas glucanas fosfatases, demonstra a capacidade deste ensaio em quantificar interações proteína-carboidrato. Uma das partes mais desafiadoras do ensaio é otimizar a faixa de concentração do substrato.
Recomendamos começar com um intervalo mais amplo para ter uma ideia e, em seguida, reduzir para um intervalo específico. Para começar, pipetar 250 microlitros de esferas de-sepharose em suspensão em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugar o conteúdo a 10.000 G durante 30 segundos a quatro graus Celsius.
Após o descarte do sobrenadante, adicionar 750 microlitros do tampão de ligação a cada tubo contendo 250 microlitros de esferas de-sefarose. Centrifugar os tubos a 10.000 G durante um minuto a quatro graus Celsius e remover o sobrenadante. Em seguida, prepare duas diluições da solução de amilopectina solubilizada para fazer uma série de soluções de amilopectina diluídas de dois mililitros.
Para preparar as esferas de amilopectina-sepharose, adicionar 250 microlitros de cada solução diluída de amilopectina aos tubos contendo 250 microlitros de esferas de-sefarose pré-equilibradas e tampão de ligação. Misture bem o conteúdo e rotule os tubos com a concentração de amilopectina correspondente. Incubar o conteúdo do tubo numa roda giratória a quatro graus Celsius durante 30 minutos e centrifugar os tubos a 10 000 G durante um minuto.
Misture 250 microlitros de esferas de amilopectina-sepharose com 100 microlitros do tampão de ligação contendo 10 microgramas de amido em excesso de quatro, ou proteína SEX4, 10 milimolares de ditiotreitol e 10 micromolares de coquetel inibidor de protease. Incubar o conteúdo a quatro graus Celsius durante 45 minutos com rotação suave. Em seguida, centrifugar os tubos a 10.000 G por um minuto e pipetar cuidadosamente 50 microlitros do sobrenadante em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Adicionar 20 microlitros de corante de página 4X SDS e 10 microlitros de água destilada a cada tubo contendo 50 microlitros das frações sobrenadantes coletadas e rotulá-los como S.Da mesma forma, adicione 20 microlitros de corante de página 4X SDS e 80 microlitros de água destilada nos tubos contendo esferas lavadas de amilopectina-sepharose SEX4. Depois de adicionar corante e água, aqueça todas as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos. Uma vez que as esferas de amilopectina-sepharose SEX4 são centrifugadas a 10.000 G por um minuto, salve o sobrenadante e rotule-o como P.Load 40 microlitros das amostras de proteína não ligadas rotuladas como S em poços de gel de poliacrilamida pré-moldados de 4 a 12% da menor concentração de substrato para a mais alta, reservando a primeira faixa para um marcador de peso molecular de proteína.
Use um segundo gel para carregar as amostras de proteína ligadas à glucana rotuladas P.Adicione o tampão de corrida de página SDS recém-preparado para ambas as câmaras do aparelho e passe o gel a 150 volts por 35 minutos ou até que a frente do corante atinja o fundo do gel. Em seguida, retire o de gel do aparelho e remova os espaçadores e placas de vidro para separar o gel para análise de western blot. Faça um litro de tampão de transferência contendo 5,8 gramas de tris base, 2,9 gramas de glicina, 0,37 gramas de SDS e 200 mililitros de metanol.
Para transferir as proteínas separadas do tamanho do gel de poliacrilamida para uma membrana de nitrocelulose, monte as esponjas, papéis de filtro, gel e membrana de nitrocelulose de acordo com o protocolo de transferência Western e funcione a 70 volts por uma hora. Após a execução do gel, incubar a membrana de nitrocelulose em uma solução proteica de 1 a 5% de albumina de soro bovino ou proteína do leite em 50 mililitros de tampão TBST por uma hora para evitar a ligação proteica inespecífica. Lave a membrana três vezes usando o tampão TBST para remover qualquer solução de bloqueio não ligada.
Em seguida, incubar a membrana por uma hora com o anticorpo diluído ligado à peroxidase de raiz forte específico para a proteína marcada com histidina. Em seguida, lave a membrana três vezes em tampão TBST para remover quaisquer anticorpos não ligados. Para imagens digitais, faça uma solução de partes iguais de soluções de substrato quimioluminescente, 750 microlitros cada em um tubo de 1,5 mililitros, e incube a membrana por pelo menos cinco minutos na solução.
Coloque a proteína de membrana de lado para baixo no scanner de manchas e execute o software de aquisição para quantificar a proteína nas frações pellet e sobrenadante. Para adquirir os dados, inicie as medições quantitativas do sinal usando o software de aquisição com o blot scanner. Normalizar todas as medidas quantitativas nas frações sobrenadante e pellet para a proteína total carregada.
No experimento de ligação de saturação, plotar a porcentagem de proteína ligada versus concentração de amilopectina e ajustar os dados usando software de análise de dados para calcular a constante de dissociação, Kd.A capacidade de ligação de SEX4 a esferas de amilopectina-sepharose foi analisada usando a página SDS. Observou-se a presença da proteína SEX4 na fração pellet e albumina do soro bovino na fração sobrenadante. W278A, um mutante SEX4 conhecido com capacidade de ligação glucana significativamente reduzida, apareceu na fração sobrenadante, indicando a utilidade e especificidade deste ensaio.
A análise de Western blotting revelou um aumento significativo na detecção de SEX4 e o método é específico para detectar fosfatos de glucanos com uma etiqueta de histidina terminal terminal. O ensaio de cossedimentação foi testado em três diferentes concentrações de SEX4. Enquanto dois microgramas de SEX4 são suficientes para visualizar através da detecção por quimioluminescência, o uso de cinco ou 10 microgramas de SEX4 permite uma detecção mais precisa.
Além disso, observou-se aumento da ligação de SEX4 com aumento da concentração de amilopectina. A afinidade de ligação da amilopectina e da proteína selvagem SEX4 em diferentes concentrações foi determinada e os dados de ligação da proteína percentual ao modelo específico de ligação de um sítio deram um Kd de aproximadamente 1,03 miligramas por mililitro. Avaliou-se a aplicabilidade deste método para medir a ligação de laforina, LSF2, milho SEX4 e batata SEX4 contra amilopectina de batata.
Os resultados demonstraram que as proteínas testadas de culturas agronomicamente importantes também estão diferencialmente ligadas à amilopectina. É crucial lembrar a normalização de todas as medidas quantitativas nas frações pellet e sobrenadante para o total de proteína carregada. Para garantir que toda a amilopectina esteja ligada às contas, guarde as frações sobrenadantes para realizar o ensaio de glicose profunda mais tarde.
A fosfatase glucana emprega mecanismos distintos para ligar, localizar e desfosforilar carboidratos. Este método permite a exploração da ligação da fosfatase glucana a diferentes domínios estruturais dentro de grandes complexos poliméricos para desfosforilação específica de posição.
