Os modelos organoides de acionamento do paciente representam geneticamente e funcionalmente seus tumores pais e, portanto, são modelos confiáveis para o estudo de novas terapêuticas e processos biológicos complexos no câncer de ovário. Ao recapitular a heterogeneidade clonal, o microambiente tumoral e as interações célula a célula in vitro, esses modelos superam as limitações das linhagens celulares cancerígenas e dos xenoenxertos derivados de pacientes. Os organoides derivados do paciente oferecem recursos de expansão e armazenamento a longo prazo e imitam a fisiologia do tumor.
Como resultado, eles são modelos ideais para o estudo de novas terapêuticas e biomarcadores preditivos. Comece a colher os organoides colocando as amostras de tumor em um prato de cultura de tecido de 10 centímetros e picando o tecido para criar uma mistura homogênea usando um bisturi descartável. Coloque a mistura de tecido homogêneo em um tubo de dissociação usando fórceps.
Para cada um a dois mililitros de tecido homogeneizado adicione sete a oito mililitros de um miligrama por mililitro tipo duas solução de colagenase em meio de base organoide e um mililitro de DNase Uma solução. Vórtice da solução a 458 G.Liquefy o tecido enquanto ele está na solução de colagenase usando a máquina de dissociação. Execute o programa 37 C sublinhar H sublinhar TDK três uma hora até que seja uma suspensão de célula única.
Uma vez feito, transfira a mistura homogeneizada para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Adicione 20 a 40 mililitros de meio de base organoide e vortex a solução a 458 G.Em seguida, filtre a solução através de um filtro celular de 100 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros recém-rotulado. Em seguida, centrifugar a mistura filtrada a 1, 650 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e aspirar o sobrenadante usando uma pipeta de pastagem de vidro.
Prepare 100 microgramas por mililitro de Dnase One e ressuspenda as células em um mililitro de solução de Dnase One adicionando a solução DNase One em termos de gota. Após 15 minutos de incubação à temperatura ambiente, adicione 25 mililitros de meio de base organoide às células e inverta para misturar. Em seguida, centrifugar as células a 1.650 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e aspirar cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de pastagem de vidro.
Ressuspenda o pellet celular recém-formado em cinco mililitros de hemácias pré-aquecidas ou tampão de lise RBC. Vórtice as soluções em cada tubo cônico a 458 G e incubar por cinco minutos. Novamente, centrifugar o pellet suspenso em tampão de lise RBC e aspirar o sobrenadante usando uma pipeta de pastagem de vidro.
Lave o pellet com PBS de 10 mililitros e martele as células antes da centrifugação das células. Para um pellet de célula grande, aspirar o PBS e adicionar um mililitro do meio de base organoide em cima do pellet. Após o vórtice da solução, transfira de 300 a 400 microlitros da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga.
Após cinco minutos de centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressussuscitá-lo em extrato de membrana basal, ou BME, e meio de base organoide usando pontas frias. Chapear a solução de célula ressuspensa numa placa de seis poços em alíquotas de 40 microlitros. Placa até cinco alíquotas por poço.
Coloque imediatamente a placa do poço na incubadora por 20 minutos e, após a incubação, adicione suavemente dois mililitros do meio organoide completo em cada poço. Adicione um mililitro de meio de base organoide a cada poço e pipete o meio para cima e para baixo diretamente nas abas organoides para dissociação. Recolha todo o meio que contém os pellets ressuspensos num tubo cónico de 15 mililitros.
Em seguida, centrifugar o tubo cônico de 15 mililitros contendo a mistura por cinco minutos antes de aspirar o sobrenadante. Adicione um mililitro de enzima recombinante livre de origem animal ao pellet celular. Misture por vórtice e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Após 15 minutos de incubação em banho-maria de 37 graus Celsius e cinco minutos de centrifugação, aspirar o sobrenadante. Ressuspeite o pellet em BME e meio de base organoide e pratique a solução celular ressuspensa em uma placa de seis poços em alíquotas de 40 microlitros. Placa até cinco alíquotas por poço.
Após 20 minutos de incubação, adicione suavemente dois mililitros do meio organoide completo em cada poço. Ressuspeite o pellet de célula organoide de passagem em 0,5 a um mililitro de Meio de Congelamento de Cultura de Células de Recuperação e transfira um mililitro para cada frasco de crio antes de transferi-los para menos 80 graus e tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. Descongele os organoides transferindo os frascos de crio armazenados em nitrogênio líquido para banho-maria de 37 graus Celsius.
Uma vez descongelados, transfira os organoides para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifuga-os antes de aspirar o sobrenadante. Em seguida, adicione um mililitro de PBS ao pellet e transfira o pellet ressuspenso para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro Após a centrifugação a 1.650 G por cinco minutos a quatro graus Celsius, aspirar cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de pastagem de vidro. Ressuspeite o pellet em BME e meio de base organoide e pratique as células ressuspensas em uma placa de seis poços em alíquotas de 40 microlitros.
Coloque até cinco alíquotas por poço. Coloque imediatamente a placa na incubadora por 20 minutos antes de adicionar dois mililitros de meio organoide completo aos poços. Os organoides foram estabelecidos ao longo de 10 dias, após os quais demonstraram organoides discretos em cultura.
As culturas organoides derivadas de pacientes foram avaliadas incorporando-as em agarose e avaliando-as com coloração de hematoxilina e eosina. É importante considerar os desafios de trabalhar com BME. A ressuspensão do pellet celular e do BME deve ser feita no gelo, garantindo que nenhuma bolha seja formada no processo.
Esta técnica permite aprofundar as pesquisas sobre o impacto da quimioterapia na geração e desenvolvimento de organoides devido aos problemas encontrados por pacientes submetidos à quimioterapia neoadjuvante.
