Модели органоидов пациента генетически и функционально представляют их родительские опухоли и, таким образом, являются надежными моделями для изучения новых терапевтических средств и сложных биологических процессов при раке яичников. Повторяя клональную гетерогенность, микроокружение опухоли и межклеточные взаимодействия in vitro, эти модели преодолевают ограничения линий раковых клеток и ксенотрансплантатов, полученных от пациентов. Органоиды, полученные от пациентов, обеспечивают возможности долгосрочного расширения и хранения и имитируют физиологию опухоли.
В результате они являются идеальными моделями для изучения новых терапевтических средств и прогностических биомаркеров. Начните сбор органоидов, поместив образцы опухоли в 10-сантиметровую чашку для культивирования тканей и измельчив ткань для создания однородной смеси с помощью одноразового скальпеля. Поместите однородную тканевую смесь в диссоциационную трубку с помощью щипцов.
На каждые один-два миллилитра гомогенизированной ткани добавляют семь-восемь миллилитров одного миллиграмма на миллилитр раствора коллагеназы второго типа в органоидной базовой среде и один миллилитр раствора ДНКазы One. Вихревый раствор при 458 г. Разжижают ткань, пока она находится в растворе коллагеназы, с помощью диссоциационной машины. Запустите программу 37 C, подчеркните H, подчеркните TDK три, один час, пока не получится одноклеточная суспензия.
После этого перелейте гомогенизированную смесь в новую коническую трубку объемом 50 миллилитров. Добавьте от 20 до 40 миллилитров органоидной основной среды и встряхните раствор при 458 г. Затем отфильтруйте раствор через 100-микрометровый сетчатый фильтр в недавно помеченную коническую трубку объемом 50 миллилитров. Затем центрифугируйте отфильтрованную смесь при температуре 1 650 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастбищной пипетки.
Приготовьте 100 микрограммов на миллилитр Dnase One и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре раствора Dnase One, добавив раствор DNase One по каплям. После 15 минут инкубации при комнатной температуре добавьте в клетки 25 миллилитров органоидной основной среды и перемешайте. Затем центрифугируйте клетки при 1 650 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и тщательно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастбищной пипетки.
Ресуспендируйте вновь образованную клеточную гранулу в пяти миллилитрах предварительно подогретого эритроцита или буфера лизиса эритроцитов. Встряхните растворы в каждой конической трубке при 458 G и инкубируйте в течение пяти минут. Опять же, центрифугируйте гранулы, взвешенные в буфере лизиса эритроцитов, и аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастбищной пипетки.
Промойте гранулы 10-миллилитровым PBS и перемешайте ячейки перед центрифугированием ячеек. Для гранул с большими ячейками аспирируйте PBS и добавьте один миллилитр органоидной основной среды поверх гранулы. После вихтывания раствора перенесите от 300 до 400 микролитров клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку.
После пяти минут центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте ее в экстракте базальной мембраны, или BME, и среде органоидного основания с помощью холодных наконечников. Поместите ресуспендированный клеточный раствор в шестилуночную пластину в аликвоты объемом 40 микролитров. Пластина до пяти аликвот на лунку.
Сразу же поместите луночную пластину в инкубатор на 20 минут, а после инкубации аккуратно добавьте в каждую лунку по два миллилитра полной органоидной среды. Добавьте по одному миллилитру органоидной основной среды в каждую лунку и нанесите питатель пипеткой вверх и вниз непосредственно на выступы органоидов для диссоциации. Соберите всю среду, содержащую ресуспендированные гранулы, в коническую трубку объемом 15 миллилитров.
Затем центрифугируйте 15-миллилитровую коническую пробирку, содержащую смесь, в течение пяти минут перед аспирацией надосадочной жидкости. Добавьте один миллилитр свободного рекомбинантного фермента животного происхождения в клеточную гранулу. Перемешайте вихревым способом и перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.
После 15 минут инкубации на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия и пяти минут центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируют гранулу в BME и среде органоидного основания и помещают ресуспендированный клеточный раствор в шестилуночную пластину в аликвотах объемом 40 микролитров. Пластина до пяти аликвот на лунку.
После 20 минут инкубации аккуратно добавьте в каждую лунку по два миллилитра полной органоидной среды. Ресуспендируйте гранулы органоидных клеток в 0,5-один миллилитр замораживающей среды для восстановительных клеточных культур и перенесите по одному миллилитру в каждый криофлакон перед переносом их в минус 80 градусов и резервуар с жидким азотом для длительного хранения. Разморозьте органоиды, перенеся криофлаконы, хранящиеся в жидком азоте, на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия.
После размораживания перенесите органоиды в коническую трубку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте их перед аспирацией надосадочной жидкости. Затем добавьте один миллилитр PBS в гранулу и перенесите ресуспендированную гранулу в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. После центрифугирования при 1 650 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия осторожно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастбищной пипетки. Ресуспендируют гранулу в BME и среде органоидного основания и помещают ресуспендированные клетки на шестилуночную пластину в аликвотах объемом 40 микролитров.
Поместите до пяти аликвот на лунку. Сразу же поместите тарелку в инкубатор на 20 минут, прежде чем добавлять в лунки два миллилитра полной органоидной среды. Органоиды были установлены в течение 10 дней, после чего они продемонстрировали дискретные органоиды в культуре.
Органоидные культуры, полученные от пациентов, оценивали путем встраивания их в агарозу и оценки с помощью окрашивания гематоксилином и эозином. Важно учитывать трудности работы с BME. Ресуспендирование клеточной гранулы и BME должно производиться на льду, чтобы в процессе не образовывались пузырьки.
Этот метод позволяет проводить дальнейшие исследования влияния химиотерапии на генерацию и развитие органоидов из-за проблем, с которыми сталкиваются пациенты, прошедшие неоадъювантную химиотерапию.
