تمثل النماذج العضوية التي يقودها المريض وراثيا ووظيفيا الأورام الأم ، وبالتالي فهي نماذج موثوقة لدراسة العلاجات الجديدة والعمليات البيولوجية المعقدة في سرطان المبيض. من خلال تلخيص عدم التجانس النسيلي ، والبيئة المكروية للورم ، والتفاعلات بين الخلايا في المختبر ، تتغلب هذه النماذج على قيود خطوط الخلايا السرطانية والطعوم الخارجية المشتقة من المريض. توفر المواد العضوية المشتقة من المريض قدرات توسع وتخزين طويلة الأجل وتحاكي فسيولوجيا الورم.
ونتيجة لذلك ، فهي نماذج مثالية لدراسة العلاجات الجديدة والمؤشرات الحيوية التنبؤية. ابدأ في حصاد المواد العضوية عن طريق وضع عينات الورم في طبق زراعة الأنسجة 10 سم وفرم الأنسجة لإنشاء خليط متجانس باستخدام مشرط يمكن التخلص منه. ضع خليط الأنسجة المتجانسة في أنبوب تفكك باستخدام ملقط.
لكل واحد إلى ملليلتر من الأنسجة المتجانسة أضف سبعة إلى ثمانية ملليلتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر من النوع الثاني من محلول كولاجيناز في وسط قاعدة عضوي وملليلتر واحد من محلول DNase One. دوامة الحل في 458 G.Liquefy الأنسجة أثناء وجودها في محلول كولاجيناز باستخدام آلة التفكك. قم بتشغيل البرنامج 37 C شرطة سفلية H شرطة سفلية TDK ثلاث ساعات واحدة حتى يتم تعليق خلية واحدة.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقل الخليط المتجانس إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر. أضف 20 إلى 40 ملليلتر من الوسط الأساسي العضوي والدوامة المحلول عند 458 جم ، ثم قم بتصفية المحلول من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر المسمى حديثا. بعد ذلك ، قم بطرد الخليط المصفى عند 1،650 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية واستنشاق المادة الطافية باستخدام ماصة مرعى زجاجية.
تحضير 100 ميكروغرام لكل مليلتر Dnase One وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من محلول Dnase One عن طريق إضافة محلول DNase One الحكيم. بعد 15 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، أضف 25 مل من وسط القاعدة العضوية إلى الخلايا واقلبها للخلط. ثم قم بطرد الخلايا عند 1،650 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية واستنشاق المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة مرعى زجاجية.
أعد تعليق حبيبات الخلايا المشكلة حديثا في خمسة ملليلتر من خلايا الدم الحمراء الدافئة مسبقا أو محلول تحلل كرات الدم الحمراء. دوامة المحاليل في كل أنبوب مخروطي عند 458 جم واحتضانها لمدة خمس دقائق. مرة أخرى ، قم بطرد الحبيبات المعلقة في محلول تحلل كرات الدم الحمراء واستنشاق المادة الطافية باستخدام ماصة مرعى زجاجية.
غسل بيليه مع 10 ملليلتر PBS ودوامة الخلايا قبل الطرد المركزي للخلايا. بالنسبة لحبيبات الخلية الكبيرة ، قم بشفط PBS وإضافة ملليلتر واحد من وسط القاعدة العضوية أعلى الحبيبات. بعد دوامة المحلول ، انقل 300 إلى 400 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي صغير.
بعد خمس دقائق من الطرد المركزي ، قم بنضح المادة الطافية وإعادة تعليقها في مستخلص الغشاء القاعدي ، أو BME ، ووسط القاعدة العضوية باستخدام أطراف باردة. ضع محلول الخلية المعاد تعليقه في صفيحة من ستة آبار في 40 ميكرولتر من القسامة. لوحة تصل إلى خمسة حصص لكل بئر.
ضع صفيحة البئر على الفور في الحاضنة لمدة 20 دقيقة ، وبعد الحضانة ، أضف برفق ملليلتر من الوسط العضوي الكامل في كل بئر. أضف ملليلتر واحد من وسط القاعدة العضوية إلى كل بئر وقم بسحب الوسائط لأعلى ولأسفل مباشرة على علامات التبويب العضوية للتفكك. اجمع كل الوسط الذي يحتوي على الكريات المعاد تعليقها في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
ثم ، الطرد المركزي الأنبوب المخروطي 15 ملليلتر الذي يحتوي على الخليط لمدة خمس دقائق قبل استنشاق المادة الطافية. أضف ملليلترا واحدا من الإنزيم المؤتلف الحر من أصل حيواني إلى حبيبات الخلية. امزج عن طريق الدوامة وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.
بعد 15 دقيقة من الحضانة في حمام مائي 37 درجة مئوية وخمس دقائق من الطرد المركزي ، استنشق الطاف. أعد تعليق الحبيبات في BME ووسط القاعدة العضوية وقم بطلاء محلول الخلية المعاد تعليقه في صفيحة من ستة آبار في حصص 40 ميكرولتر. لوحة تصل إلى خمسة حصص لكل بئر.
بعد 20 دقيقة من الحضانة ، أضف برفق ملليلتر من الوسط العضوي الكامل في كل بئر. أعد تعليق حبيبات الخلايا العضوية في 0.5 إلى ملليلتر واحد من وسط تجميد ثقافة الخلايا الاسترداد وانقل ملليلتر واحد إلى كل قارورة تبريد قبل نقلها إلى 80 درجة تحت الصفر وخزان النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل. قم بإذابة المواد العضوية عن طريق نقل قوارير التبريد المخزنة في النيتروجين السائل إلى حمام مائي 37 درجة مئوية.
بمجرد إذابتها ، انقل المواد العضوية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر وطردها مركزيا قبل استنشاق المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من PBS إلى الحبيبات وانقل الحبيبات المعاد تعليقها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر بعد الطرد المركزي عند 1،650 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، قم باستنشاق المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة مرعى زجاجية. أعد تعليق الحبيبات في BME ووسط القاعدة العضوية وقم بطلاء الخلايا المعاد تعليقها على صفيحة من ستة آبار في 40 ميكرولتر من القسامة.
ضع ما يصل إلى خمسة حصص لكل بئر. ضع اللوحة على الفور في الحاضنة لمدة 20 دقيقة قبل إضافة ملليلتر من الوسط العضوي الكامل إلى الآبار. تم إنشاء المواد العضوية على مدى 10 أيام وبعد ذلك أظهروا عضويات منفصلة في الثقافة.
تم تقييم الثقافات العضوية المشتقة من المرضى عن طريق دمجها في الأغاروز وتقييمها باستخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين. من المهم النظر في تحديات العمل مع BME. يجب أن تتم إعادة تعليق حبيبات الخلية و BME على الجليد لضمان عدم تكوين فقاعات في هذه العملية.
تسمح هذه التقنية بإجراء مزيد من الأبحاث حول تأثير العلاج الكيميائي على توليد الأعضاء وتطورها بسبب المشاكل التي يواجهها المرضى الذين خضعوا للعلاج الكيميائي المساعد الجديد.
