환자 드라이브 오가노이드 모델은 유전적 및 기능적으로 모 종양을 나타내므로 난소암에서 새로운 치료법 및 복잡한 생물학적 과정을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 모델입니다. 클론 이질성, 종양 미세 환경 및 시험관 내 세포 대 세포 상호 작용을 요약함으로써 이러한 모델은 암 세포주 및 환자 유래 이종 이식편의 한계를 극복합니다. 환자 유래 오가노이드는 장기 확장 및 저장 기능을 제공하고 종양 생리학을 모방합니다.
결과적으로 새로운 치료법 및 예측 바이오마커 연구에 이상적인 모델입니다. 종양 샘플을 10cm 조직 배양 접시에 넣고 조직을 다져서 일회용 메스를 사용하여 균질한 혼합물을 만들어 오가노이드 수확을 시작합니다. 집게를 사용하여 균질 조직 혼합물을 해리 튜브에 넣습니다.
균질화된 조직 1 내지 2밀리리터마다 오가노이드 염기 배지에 밀리리터당 1밀리그램의 2형 콜라게나제 용액 7 내지 8밀리리터와 DNase 1 용액 1밀리리터를 첨가한다. 458 G.Lique에 있는 458 G.Liquidy에 있는 해결책에 소용돌이 모양 조직은 해리 기계를 사용하여 collagenase 해결책에 있는 동안 합니다. 37C 밑줄, H 밑줄, TDK 3이 단일 세포 현탁액이 될 때까지 1시간 동안 프로그램을 실행한다.
완료되면 균질화된 혼합물을 새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 20 내지 40 밀리리터의 오가노이드 베이스 배지를 첨가하고 458 G에서 용액을 와동시킨 다음 100 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 용액을 새로 라벨이 붙은 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 여과한다. 다음으로, 여과된 혼합물을 섭씨 4도에서 5분 동안 1, 650 G에서 원심분리하고, 유리 목초지 피펫을 이용하여 상층액을 흡인한다.
밀리리터당 100마이크로그램의 Dnase One을 준비하고 드롭 와이즈 DNase One 용액을 추가하여 1밀리리터의 Dnase One 용액에 세포를 재현탁합니다. 실온에서 15분 동안 배양한 후 25밀리리터의 오가노이드 염기 배지를 세포에 첨가하고 뒤집어 혼합합니다. 그런 다음 세포를 섭씨 4도에서 5 분 동안 1, 650 G에서 원심 분리하고 유리 목초지 피펫을 사용하여 상청액을 조심스럽게 흡인합니다.
새로 형성된 세포 펠릿을 5밀리리터의 미리 데워진 적혈구 또는 RBC 용해 완충액에 재현탁합니다. 각 원뿔형 튜브의 용액을 458G에서 소용돌이 치고 5 분 동안 배양합니다. 다시, 펠릿을 RBC 용해 완충액에 현탁하여 원심분리하고, 유리 목초지 피펫을 사용하여 상청액을 흡인한다.
펠렛을 10 밀리리터 PBS로 세척하고 세포를 원심분리하기 전에 세포를 와동시킨다. 큰 세포 펠릿의 경우 PBS를 흡인하고 펠릿 위에 오가노이드 기본 배지 1밀리리터를 추가합니다. 용액을 와동시킨 후, 300 내지 400 마이크로리터의 세포 현탁액을 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다.
5분 동안 원심분리한 후 상층액을 흡인하고 기저막 추출물(BME)과 콜드 팁을 사용하여 오가노이드 기본 배지에 재현탁합니다. 재현탁된 세포 용액을 40 마이크로리터 분취량의 6웰 플레이트에 플레이트합니다. 웰 당 최대 5 개의 부분 표본을 플레이트합니다.
즉시 웰 플레이트를 인큐베이터에 20 분 동안 넣고 인큐베이션 후 2 밀리리터의 완전한 오가노이드 배지를 각 웰에 부드럽게 첨가한다. 각 웰에 1밀리리터의 오가노이드 기본 배지를 추가하고 해리를 위해 배지를 오가노이드 탭에 직접 위아래로 피펫팅합니다. 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 재현 탁 된 펠릿을 포함하는 모든 매체를 수집하십시오.
이어서, 상층액을 흡인하기 전에 혼합물을 함유하는 15 밀리리터 원뿔형 튜브를 5분 동안 원심분리한다. 1 밀리리터의 동물 유래 유리 재조합 효소를 세포 펠릿에 첨가하십시오. 와동으로 혼합하고 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
섭씨 37도의 수조에서 15분간 배양하고 5분간 원심분리한 후 상층액을 흡인합니다. 펠릿을 BME 및 오가노이드 기본 배지에 재현탁하고 재현탁된 세포 용액을 40마이크로리터 분취량으로 6웰 플레이트에 플레이트합니다. 웰 당 최대 5 개의 부분 표본을 플레이트합니다.
20 분 배양 후, 2 밀리리터의 완전한 오가노이드 배지를 각 웰에 부드럽게 첨가한다. 통과 오가노이드 세포 펠릿을 0.5-1밀리리터의 회수 세포 배양 냉동 배지에 재현탁하고 각 극저온 바이알에 1밀리리터를 옮긴 후 영하 80도로 옮기고 장기 보관을 위해 액체 질소 탱크에 옮깁니다. 액체 질소에 보관된 극저온 바이알을 섭씨 37도 수조로 옮겨 오가노이드를 해동합니다.
해동되면 오가노이드를 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 원심분리한 후 상층액을 흡인합니다. 다음으로, 펠렛에 PBS 1 밀리리터를 첨가하고, 재현탁된 펠렛을 1.5 밀리리터 미세원심분리 튜브에 옮기고, 섭씨 4도에서 5분 동안 1, 650 G에서 원심분리한 후, 유리 목초지 피펫을 이용하여 상층액을 조심스럽게 흡인한다. 펠릿을 BME 및 오가노이드 기본 배지에 재현탁하고 재현탁된 세포를 40마이크로리터 분취량으로 6웰 플레이트에 플레이트합니다.
웰 당 최대 5 개의 부분 표본을 배치하십시오. 즉시 플레이트를 인큐베이터에 20분 동안 넣은 후 2밀리리터의 완전한 오가노이드 배지를 웰에 추가합니다. 오가노이드는 10일 후에 확립된 후 배양에서 분리된 오가노이드를 입증했습니다.
환자 유래 오가노이드 배양은 이들을 아가로스에 내장하고 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 평가하여 평가했습니다. BME 작업의 어려움을 고려하는 것이 중요합니다. 세포 펠릿과 BME의 재현탁은 얼음 위에서 이루어져야 공정에서 기포가 형성되지 않습니다.
이 기술은 신보강 화학요법을 받은 환자가 직면하는 문제로 인해 오가노이드 생성 및 발달에 대한 화학요법의 영향에 대한 추가 연구를 가능하게 합니다.
