Los modelos de organoides impulsados por pacientes representan genética y funcionalmente sus tumores progenitores y, por lo tanto, son modelos confiables para estudiar nuevas terapias y procesos biológicos complejos en el cáncer de ovario. Al recapitular la heterogeneidad clonal, el microambiente tumoral y las interacciones in vitro de célula a célula, estos modelos superan las limitaciones de las líneas celulares cancerosas y los xenoinjertos derivados del paciente. Los organoides derivados del paciente ofrecen capacidades de expansión y almacenamiento a largo plazo e imitan la fisiología tumoral.
Como resultado, son modelos ideales para el estudio de nuevas terapias y biomarcadores predictivos. Comience la recolección de los organoides colocando las muestras de tumor en un plato de cultivo de tejido de 10 centímetros y picando el tejido para crear una mezcla homogénea usando un bisturí desechable. Coloque la mezcla de tejido homogéneo en un tubo de disociación con fórceps.
Por cada uno o dos mililitros de tejido homogeneizado, agregue de siete a ocho mililitros de un miligramo por mililitro de solución de colagenasa tipo dos en medio base organoide y un mililitro de solución de DNasa Uno. Vórtice la solución a 458 G.Licuar el tejido mientras está en la solución de colagenasa utilizando la máquina de disociación. Ejecute el programa 37 C subrayar H subrayar TDK tres una hora hasta que sea una suspensión de una sola celda.
Una vez hecho esto, transfiera la mezcla homogeneizada a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Agregue de 20 a 40 mililitros de medio base organoide y vórtice la solución a 458 G.Luego filtre la solución a través de un filtro celular de 100 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros recién etiquetado. A continuación, centrifugar la mezcla filtrada a 1, 650 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y aspirar el sobrenadante con una pipeta de vidrio para pastos.
Prepare 100 microgramos por mililitro de Dnase One y resuspenda las células en un mililitro de solución de Dnase One agregando una solución de DNase One en gota. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, agregue 25 mililitros de medio base organoide a las células e invierta para mezclar. Luego centrifugar las celdas a 1, 650 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y aspirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio para pastos.
Resuspenda el pellet de células recién formado en cinco mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos o RBC precalentados. Vortex las soluciones en cada tubo cónico a 458 G e incubar durante cinco minutos. Nuevamente, centrifugar el pellet suspendido en tampón de lisis RBC y aspirar el sobrenadante usando una pipeta de vidrio para pastos.
Lave el pellet con PBS de 10 mililitros y vortex las células antes de la centrifugación de las células. Para un pellet de celda grande, aspire el PBS y agregue un mililitro del medio base organoide encima del pellet. Después de vortexar la solución, transfiera de 300 a 400 microlitros de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga.
Después de cinco minutos de centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspenderlo en extracto de membrana basal, o BME, y medio base organoide utilizando puntas frías. Colocar la solución celular resuspendida en una placa de seis pocillos en alícuotas de 40 microlitros. Planchar hasta cinco alícuotas por pozo.
Coloque inmediatamente la placa del pozo en la incubadora durante 20 minutos y, después de la incubación, agregue suavemente dos mililitros del medio organoide completo en cada pocillo. Agregue un mililitro de medio base organoide a cada pocillo y pipete el medio hacia arriba y hacia abajo directamente sobre las pestañas del organoide para la disociación. Recoger todo el medio que contiene los pellets resuspendidos en un tubo cónico de 15 mililitros.
Luego, centrifugar el tubo cónico de 15 mililitros que contiene la mezcla durante cinco minutos antes de aspirar el sobrenadante. Agregue un mililitro de enzima recombinante libre de origen animal al pellet celular. Mezclar por vórtice y transferir la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Después de 15 minutos de incubación en un baño de agua de 37 grados centígrados y cinco minutos de centrifugación, aspirar el sobrenadante. Resuspender el pellet en BME y medio base organoide y colocar la solución celular resuspendida en una placa de seis pocillos en alícuotas de 40 microlitros. Planchar hasta cinco alícuotas por pozo.
Después de 20 minutos de incubación, agregue suavemente dos mililitros del medio organoide completo en cada pocillo. Resuspenda el gránulo de células organoides de paso en 0.5 a un mililitro de medio de congelación de cultivo celular de recuperación y transfiera un mililitro a cada vial criogénico antes de transferirlos a menos 80 grados y al tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Descongele los organoides transfiriendo los viales criogénicos almacenados en nitrógeno líquido al baño de agua a 37 grados centígrados.
Una vez descongelados, transfiera los organoides a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugarlos antes de aspirar el sobrenadante. A continuación, agregue un mililitro de PBS al pellet y transfiera el pellet resuspendido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros Después de la centrifugación a 1, 650 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio para pastos. Resuspender el pellet en BME y medio base organoide y placar las células resuspendidas en una placa de seis pocillos en alícuotas de 40 microlitros.
Colocar hasta cinco alícuotas por pozo. Coloque inmediatamente la placa en la incubadora durante 20 minutos antes de agregar dos mililitros de medio organoide completo a los pocillos. Los organoides se establecieron durante 10 días después de lo cual demostraron organoides discretos en cultivo.
Los cultivos de organoides derivados de pacientes se evaluaron incrustándolos en agarosa y evaluándolos con tinción de hematoxilina y eosina. Es importante tener en cuenta los retos de trabajar con BME. La resuspensión del pellet celular y BME debe hacerse en hielo asegurando que no se formen burbujas en el proceso.
Esta técnica permite realizar más investigaciones sobre el impacto de la quimioterapia en la generación y el desarrollo de organoides debido a los problemas encontrados por los pacientes que se han sometido a quimioterapia neoadyuvante.
