Os autores gostariam de agradecer à Cooperação em Genética de Milho, ao Projeto de Genômica de Células de Milho, a Dave Jackson (Laboratório Cold Spring Harbor, NY), a Anne W. Sylvester (Laboratório Biológico Marinho, Universidade de Chicago, IL), a Andrea Gallavotti (Universidade Rutgers, NJ) e a Carolyn G. Rasmussen (Universidade da Califórnia, Riverside) por fornecerem os estoques mutantes e transgênicos, bem como a Robert F. Baker e Alexander Jurkevich do Núcleo de Microscopia de Luz Avançada da Universidade de Missouri-Columbia por sua assistência com microscopia confocal. A JMR foi apoiada pela J. William Fulbright Fellowship, The Diane P. and Robert E. Sharp Fund, e pelo Programa de Pesquisa do Genoma Vegetal da National Science Foundation (IOS-1546873) para PM. CDTC, CMRV, EDCDP e RJRR são apoiados pelo Programa de Bolsas de Estudo da Faculdade Ateneo. CDTC, EDCDP e RJRR são apoiados pela Bolsa de Graduação DOST-SEI S&T. O DODL é apoiado pelo P. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship. O RJRR é apoiado pela Aiducation International–Pathways to Higher Education Scholarship. Este trabalho foi apoiado pela Escola de Ciências e Engenharia e pela Biblioteca Rizal, Universidade Ateneo de Manila.

Métodos aprimorados para imagens de primórdios de folhas de milho

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Apresentamos dois métodos de preparação de primórdios foliares de milho para aquisição de imagens celulares. O primeiro método (protocolo seção 2) permite a medição do primórdio para análise de secção transversal, enquanto o segundo método (protocolo seção 3) permite desenrolar e achatar o primórdio para análise de montagem inteira. Esses métodos facilitam a obtenção de imagens celulares de PFs em primórdiosfoliares de milho 24 (como mostrado na Figura 4 e Figura 5) e fornecem soluções simples para os desafios de obtenção de imagens de folhas de milho em desenvolvimento. A seção 2 do protocolo reduz o tempo de dissecção e melhora a precisão da amostragem medindo os primórdios antes da secção, em vez de depender apenas dos parâmetros de estadiamento 9,16. Com a nanofita disponível comercialmente, a seção 3 do protocolo resolve o problema de longa data da obtenção de imagens de primórdios de folhas inteiras em milho. Esse protocolo melhora o método anterior, que utilizava tubos de diálise 31, sendo uma alternativa muito mais barata à TC e RM11,32,33. No entanto, quando se trata de visualizar as características anatômicas foliares e produzir resultados ótimos, ambos os protocolos apresentam algumas limitações, que são descritas na Tabela 2 e discutidas mais detalhadamente a seguir.
Na seção 2 do protocolo, encontramos dificuldade em visualizar contornos celulares em cortes transversais espessos dos primórdios foliares, e a contramarcação com corantes fluorescentes ligantes à parede celular ou à membrana plasmática não forneceu resultados satisfatórios. Por exemplo, FM 4-64 produziu resultados subótimos em comparação com o marcador FP da membrana plasmática, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Figura 3A-D). Para superar essa limitação, recomendamos o uso de um vibratomo para produzir cortes teciduais mais finos (~0,1 mm)58, o que permitirá uma imagem vívida de campo claro dos contornos celulares ou otimizando o protocolo de contramarcação 47,59.
Na seção 3 do protocolo, a principal limitação é a dificuldade de montagem da folha sem rasgar, danificar ou formar bolhas de ar, conforme detalhado nas etapas do protocolo 3.2.5-3.2.6 (Figura 3E-K). Como a folha de milho é bilateralmente simétrica, uma montagem de meia folha em vez de uma montagem de folha inteira pode ser suficiente para visualização9. Para fazer isso, o primórdio pode ser cortado com uma lâmina de barbear ao longo do eixo longitudinal depois de desenrolá-lo até a nervura central, permitindo que apenas metade da folha seja montada. Outra limitação da seção 3 do protocolo é que a espessura da folha pode limitar a resolução óptica do sinal do fluoróforo durante imagens profundas. Para resolver essa questão, é possível empregar uma técnica de limpeza de tecidos60. No entanto, descobrimos que o ClearSee61, um reagente de limpeza comumente usado para imagens de tecidos vegetais, não é compatível com o protocolo porque faz com que a amostra e a lamínula se desprenda da fita nano. Uma solução potencial para este problema poderia ser a aplicação de uma membrana semipermeável31 sobre a amostra foliar, permitindo que ela seja tratada com a solução de limpeza enquanto é mantida no lugar pela nanofita. Este método, que permite a aplicação de soluções líquidas na folha não enrolada, também pode ser utilizado para técnicas de hibridização in situ e imunolocalização de RNA montado, previamente otimizadas para o desenvolvimento de inflorescências de milho, mas não para primórdios de folhasinteiras 62,63.
Descrevemos protocolos para o milho, que apresenta primórdios foliares grandes mesmo na fase de plântula. Outras espécies de gramíneas com primórdios foliares muito menores, como arroz, cevada, trigo, Setaria e Brachypodium 16,23,64,65,66, podem requerer o uso de ferramentas adicionais de precisão para a aplicação efetiva desses protocolos. Além disso, esses protocolos não foram destinados a imagens de células vivas, que capturam processos dinâmicos em tempo real de formação de tecidos e respostas celulares. No entanto, à medida que sondas fluorescentes, tecnologias de imagem e recursos de computação continuam a avançar em imagens de células vivas para plantas67, pesquisas futuras poderiam se basear nesses protocolos para desenvolver estratégias de imagem de células vivas adaptadas às características únicas dos primórdios das folhas de gramínea.

As culturas de gramíneas são uma importante fonte de alimento e biocombustível para a população mundial1, e a melhoria da anatomia foliar tem o potencial de aumentar sua produtividade 2,3. No entanto, nosso entendimento atual de como a anatomia foliar é regulada em gramíneas é limitado4 e requer a análise dos primórdios foliares, uma vez que muitas características anatômicas e fisiológicas da folha são predeterminadas no início do desenvolvimento 5,6,7. Técnicas de imagem celular, como fluorescência e imagem confocal, são indispensáveis para o estudo da anatomia foliar e características celulares de gramíneas, mas essas técnicas são difíceis de aplicar aos primórdios foliares de gramíneas porque eles são profundamente embainhados e enrolados dentro da espiral foliar. Abordamos essa questão desenvolvendo métodos de preparação de cortes transversais e montagens foliares inteiras não enroladas para fluorescência e análise confocal de primórdios foliares de milho, um sistema modelo para o estudo da anatomia e desenvolvimento foliar de gramíneas 2,8.
A folha de milho, como todas as folhas de capim, consiste de uma lâmina em forma de alça com uma bainha que envolve o caule e a parte aérea em desenvolvimento 9,10,11,12,13. As folhas desenvolvem-se a partir do meristema apical da parte aérea (SAM) em um padrão distichoso, onde cada nova folha se inicia na posição oposta à folha anterior, resultando em duas fileiras de folhas ao longo do eixo vertical (Figura 1A)14 . O estágio de desenvolvimento de cada primórdio foliar é identificado pela sua posição em relação ao SAM, sendo o primórdio mais próximo designado como plastochron1 (P1) e os primórdios seguintes designados como P2, P3 e assim por diante (Figura 1B,C)2. Durante o desenvolvimento (Figura 1D), o primórdio foliar aparece primeiramente como um contraforte em forma de crescente ao redor da base do SAM (P1), e depois cresce em um primórdio em forma de capuz que se estende sobre o meristema (P2)9,10,11. As margens basais do capuz então se expandem lateralmente e se sobrepõem à medida que a ponta cresce para cima, formando um primórdio em forma de cone (P3-P5)10. O primórdio então cresce rapidamente em comprimento, e o limite bainha-lâmina na base torna-se mais proeminente com a formação da lígula, a projeção em forma de franja no lado adaxial da folha (P6/P7). Finalmente, a folha se desenrola ao emergir da espiral durante o crescimento em estado estacionário, no qual as células em divisão ficam restritas dentro da pequena região basal da lâmina, formando um gradiente com células em expansão e diferenciação ao longo do eixo proximal-distal (P7/P8)15. O ápice da parte aérea de uma plântula de milho contém múltiplos primórdios em diferentes estádios de desenvolvimento, tornando-se um excelente modelo para o estudo do desenvolvimento foliar8.
A análise acurada do desenvolvimento foliar inicial requer estadiamento ou o uso de critérios padronizados para definir estágios distintos de desenvolvimento do primórdio em relação a outros parâmetros de crescimento ou morfológicos. Como os primórdios foliares estão ocultos dentro da parte aérea da gramínea, os pesquisadores normalmente utilizam parâmetros como a idade da planta ou o tamanho das folhas emergentes como preditores para os estágios e tamanhos dos primórdios foliares 9,16. No milho, a idade cronológica da planta é determinada pelo número de dias após o plantio ou pela germinação (DAP/DAG)17,18. O estágio vegetativo (estágio V) é determinado pela folha mais superior com colar visível, uma linha pálida no lado abaxial entre a lâmina e a bainha que corresponde à posição da lígula e aurículas, um par de regiões em forma de cunha na base da lâmina (Figura 1A,B)17,19 . Entre 20 e 25 DAG, o SAM transita para um meristema de inflorescência e deixa de produzir novas folhas20. As taxas de crescimento dos primórdios foliares do milho podem variar dependendo do ambiente e do genótipo da planta. Por esta razão, a idade da planta e o tamanho das folhas emergentes não podem prever com precisão os tamanhos dos primórdios foliares; no entanto, o uso desses parâmetros pode ajudar a prever a faixa de estágios e tamanhos dos primórdios para fins experimentais.
A análise de cortes transversais é um método popular para examinar a anatomia foliar e o desenvolvimento em milho e outras gramíneas, pois permite a amostragem de múltiplos plastócronos em uma única seção ao longo da parte aérea21,22,23. Este método também é conveniente para imagens celulares de amostras frescas, pois as folhas circundantes servem como um andaime que mantém os primórdios foliares no lugar durante a seccionagem e montagem24. No entanto, uma desvantagem deste método é que pode ser difícil localizar precisamente o plastocrono alvo e a região dentro do primórdio ao seccionar a partir de um broto intacto. Além disso, como o crescimento foliar varia entre os plastócronos e ao longo do eixo proximal-distal2,5, uma amostragem imprecisa poderia resultar em uma interpretação incorreta do estágio de desenvolvimento e da região do primórdio em uma determinada seção. Portanto, o desenvolvimento de um método para amostragem precisa de cortes transversais é fundamental para garantir a exatidão e a reprodutibilidade das análises anatômicas e de desenvolvimento dos primórdios foliares das gramíneas.
A análise da montagem foliar inteira permite a investigação abrangente e integrativa de processos teciduais e celulares que ocorrem em escala de órgãos inteiros, como crescimentoproliferativo25 e padronização venosa26,27,28. O método fornece uma visão paradérmica da folha, permitindo a descoberta de processos e padrões distintos que, de outra forma, seriam difíceis de detectar usando a análise de cortes transversais24,27. Ao contrário de Arabidopsis, onde já existem métodos estabelecidos para obtenção de imagens de montagens de folhas inteiras29,30, atualmente não há um método padrão para obtenção de imagens de montagens de folhas inteiras não enroladas em gramíneas. Um protocolo prévio para desenrolar primórdios isolados de folhas de milho envolveu materiais incomuns e não foi adequado para imagens celulares31. Técnicas avançadas de imagem, como a tomografia computadorizada (TC) e a ressonância magnética (RM), podem adquirir informações anatômicas 3D sem isolar e desenrolar os primórdios 11,32,33, mas são caras e requerem equipamentos especializados. O desenvolvimento de uma técnica para superar as restrições impostas pela morfologia laminada e cônica dos primórdios foliares em milho e outras gramíneas avançaria nas investigações sobre suas características anatômicas e de desenvolvimento.
Aqui, apresentamos métodos para preparar cortes transversais e montagens inteiras de primórdios foliares de milho para fluorescência e imagens confocais. Utilizamos esses métodos para quantificar o número de nervuras e mapear a distribuição hormonal espaço-temporal nos primórdios foliares do milho com proteínas fluorescentes (FPs)24. O primeiro método envolve a remoção da porção superior de folhas mais velhas de mudas de milho com um decapador de arame (Figura 1E). Ao expor a ponta do primórdio (P5-P7), torna-se possível determinar seu comprimento sem ter que remover completamente as folhas mais antigas ao redor, permitindo assim um corte fácil e preciso. O segundo método envolve o desenrolar e montar primórdios de folhas inteiras (P3-P7) com nanofita transparente de dupla face (Figura 1F). Esses métodos são adequados para visualizar vários FPs24, mas precisam de otimização para o uso de corantes fluorescentes e reagentes de limpeza. Além disso, descrevemos alguns procedimentos para achatar z-stacks, costurar imagens e mesclar canais no ImageJ/FIJI34, que se aplicam às imagens produzidas pelos dois métodos. Esses métodos são úteis para fluorescência de rotina ou imagens confocais de folhas de milho, mas também podem ser adaptados para outras espécies de gramíneas modelo, como arroz, Setaria e Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> Figura 1: Organização e morfologia dos primórdios foliares do milho e visão geral dos métodos . (A) Representação esquemática de uma plântula de milho. O milho tem uma filotaxia distichosa, com a nova folha iniciando na posição oposta à folha anterior. O número de folhas indica a ordem cronológica em que as folhas emergiram da germinação (i.e., primeira folha, L1; segunda folha, L2; terceira folha, L3; etc.). Cada folha possui uma lâmina distal e uma bainha basal delineada por um colar que corresponde à lígula e aurícula. A folha mais superior com o colar visível denota o estágio vegetativo. A muda neste exemplo está no estágio V2, com o colar L2 (ponta de seta) visível. O ícone da tesoura indica o local no mesocótilo (me) onde a muda deve ser cortada para ser coletada. (B) Representação esquemática da parte aérea dissecada mostrando L1 a L4 isolados, com os primórdios foliares L5 a L9 mostrados como imagem ampliada em (C). O número de plastocrono indica a posição do primórdio em relação ao SAM, com o primórdio foliar mais jovem (P1) mais próximo do SAM e o primórdio foliar mais velho (P2, P3, P4 e assim por diante) sucessivamente mais distante2. (D) Representação esquemática da morfologia dos primórdios foliares do milho de P1 a P5. (E) Visão geral esquemática do método de análise de secção transversal dos primórdios foliares do milho. (1) Corte as folhas mais velhas com um decapante de arame. (2) Meça o primórdio e corte a parte aérea. (3) Monte a seção em uma lâmina para aquisição de imagens e processamento (4, 5). (F) Visão geral esquemática do método de análise de montagem total dos primórdios foliares do milho. (1) Retire as folhas circundantes para extrair o primórdio. (2) Corte e desenrole o primórdio na nanofita. (3) Montar a amostra para aquisição de imagens e processamento (4, 5). Abreviações: L = folha; bl = lâmina; sh = bainha; co = colarinho; me = mesocótilo; V = vegetativo; P = plastocrono; SAM = meristema apical da parte aérea. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

No milho (Zea mays) e em outras gramíneas (Poaceae), os primórdios foliares são profundamente embainhados e enrolados dentro da espiral foliar, dificultando o estudo do desenvolvimento foliar inicial. Aqui, descrevemos métodos para preparar cortes transversais e montagens inteiras não enroladas de primórdios foliares de milho para fluorescência e imagens confocais. O primeiro método utiliza um decapador de arame para remover as porções superiores das folhas mais velhas, expondo a ponta do primórdio foliar e permitindo sua medição para uma amostragem mais precisa da seção transversal. O segundo método usa fita nano transparente de dupla face para desenrolar e montar primórdios de folhas inteiras para geração de imagens. Mostramos a utilidade dos dois métodos na visualização e análise de repórteres de proteínas fluorescentes em milho. Estes métodos fornecem uma solução para os desafios apresentados pela morfologia distinta dos primórdios foliares do milho e serão úteis para visualizar e quantificar características anatômicas e de desenvolvimento foliar em milho e outras espécies de gramíneas.

Grass crops are a major source of food and biofuel for the global population1, and improving leaf anatomy has the potential to increase their productivity2,3. However, our current understanding of how leaf anatomy is regulated in grasses is limited4 and requires the analysis of leaf primordia, as many anatomical and physiological traits of the leaf are predetermined early in development5,6,7. Cellular imaging techniques, such as fluorescence and confocal imaging, are indispensable for studying grass leaf anatomy and cellular traits, but these techniques are difficult to apply to grass leaf primordia because they are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl. We addressed this issue by developing methods for preparing transverse sections and unrolled whole-leaf mounts for fluorescence and confocal analysis of maize leaf primordia, a model system for studying grass leaf anatomy and development2,8.
The maize leaf, like all grass leaves, consists of a strap-like blade with a sheath that wraps around the stem and developing shoot9,10,11,12,13. The leaves develop from the shoot apical meristem (SAM) in a distichous pattern, where each new leaf initiates in the opposite position of the previous leaf, resulting in two ranks of leaves along the vertical axis&#160;(Figure 1A)14 . The developmental stage of each leaf primordium is identified by its position relative to the SAM, with the closest primordium designated as plastochron1 (P1) and the following primordia designated as P2, P3, and so on (Figure 1B,C)2. During development (Figure 1D), the leaf primordium first appears as a crescent-shaped buttress around the base of the SAM (P1), and then grows into a hood-shaped primordium that extends over the meristem (P2)9,10,11. The basal margins of the hood then expand laterally and overlap each other as the tip grows upward, forming a cone-shaped primordium (P3-P5)10. The primordium then rapidly grows in length, and the sheath-blade boundary at the base becomes more prominent with the formation of the ligule, the fringe-like projection on the adaxial side of the leaf (P6/P7). Finally, the leaf unrolls as it emerges from the whorl during steady-state growth, in which the dividing cells are restricted within the small basal region of the blade, forming a gradient with expanding and differentiating cells along the proximal-distal axis (P7/P8)15. The shoot apex of a maize seedling contains multiple primordia at different stages of development, making it an excellent model for studying leaf development8.
Accurate analysis of early leaf development requires staging or the use of standardized criteria to define distinct stages of primordium development in relation to other growth or morphological parameters. Because the leaf primordia are hidden within the grass shoot, investigators typically use parameters such as the age of the plant or the size of the emerging leaves as predictors for the stages and sizes of the leaf primordia9,16. In maize, the chronological age of the plant is determined either by the number of days after planting or germination (DAP/DAG)17,18. The vegetative stage (V stage) is determined by the uppermost leaf with a visible collar, a pale line on the abaxial side between the blade and the sheath that corresponds to the position of the ligule and auricles, a pair of wedge-shaped regions at the base of the blade&#160;(Figure 1A,B)17,19 . Between 20 and 25 DAG, the SAM transitions into an inflorescence meristem and ceases to produce new leaves20. The growth rates of maize leaf primordia can vary depending on the environment and the genotype of the plant. For this reason, plant age and the size of the emerging leaves cannot accurately predict the sizes of leaf primordia; however, using these parameters can help predict the range of primordia stages and sizes for experimental purposes.
Transverse section analysis is a popular method for examining leaf anatomy and development in maize and other grasses because it allows for the sampling of multiple plastochrons in a single section across the shoot21,22,23. This method is also convenient for cellular imaging of fresh samples, as the surrounding leaves serve as a scaffold&#160;that keeps the leaf primordia in place during sectioning and mounting24. However, a disadvantage of this method is that it can be challenging to precisely locate the target plastochron and region within the primordium when sectioning from an intact shoot. Furthermore, because leaf growth varies across plastochrons and along the proximal-distal axis2,5, imprecise sampling could result in an incorrect interpretation of the developmental stage and region of the primordium in a given section. Therefore, developing a method for precise transverse section sampling is critical for ensuring the accuracy and reproducibility of anatomical and developmental analyses of grass leaf primordia.
Whole-leaf mount analysis enables the comprehensive and integrative investigation of tissue and cellular processes that occur at the whole-organ scale, such as proliferative growth25 and vein patterning26,27,28. The method provides a paradermal overview of the leaf, allowing the discovery of distinct processes and patterns that would otherwise be difficult to detect using transverse section analysis24,27. Unlike in Arabidopsis, where there are already established methods for imaging whole-leaf mounts29,30, there is currently no standard method for imaging unrolled whole-leaf mounts in grasses. A previous protocol for unrolling isolated maize leaf primordia involved uncommon materials and was not suitable for cellular imaging31. Advanced imaging techniques, such as computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), can acquire 3D anatomical information without isolating and unrolling the primordia11,32,33, but they are expensive and require specialized equipment. Developing a technique to overcome the constraints imposed by the rolled and conical morphology of leaf primordia in maize and other grasses would advance investigations into their anatomical and developmental traits.
Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. We used these methods to quantify vein number and map the spatial-temporal hormone distribution in maize leaf primordia with fluorescent proteins (FPs)24. The first method involves removing the upper portion of older leaves from maize seedlings with a wire stripper (Figure 1E). By exposing the tip of the primordium (P5-P7), it becomes possible to determine its length without having to completely remove the older surrounding leaves, thus enabling easy and accurate sectioning. The second method involves unrolling and mounting whole-leaf primordia (P3-P7) with clear, double-sided nano tape (Figure 1F). These methods are suitable for visualizing various FPs24&#160;but need optimization for using fluorescent dyes and clearing reagents. In addition, we outline some procedures for flattening z-stacks, stitching images, and merging channels in ImageJ/FIJI34, which apply to the images produced by the two methods. These methods are useful for routine fluorescence or confocal imaging of maize leaves, but they can also be adapted for other model grass species, such as rice, Setaria, and Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" /> 
Figure 1: Organization and morphology of maize leaf primordia and overview of the methods. (A) Schematic representation of a maize seedling. Maize has a distichous phyllotaxy, with the new leaf initiating at the opposite position of the previous leaf. The leaf number indicates the chronological order in which the leaves emerged from germination (i.e., first leaf, L1; second leaf, L2; third leaf, L3; etc.). Each leaf has a distal blade and a basal sheath delineated by a collar that corresponds to the ligule and auricle. The uppermost leaf with the collar visible denotes the vegetative stage. The seedling in this example is at the V2 stage, with the L2 collar (arrowhead) visible. The scissors icon indicates the location at the mesocotyl (me) where the seedling must be cut in order to be collected. (B) Schematic representation of the dissected shoot showing isolated L1 to L4, with the leaf primordia L5 to L9 shown as an enlarged image in (C). The plastochron number indicates the position of the primordium relative to the SAM, with the youngest leaf primordium (P1) closest to the SAM and the older leaf primordia (P2, P3, P4, and so on) successively farther away2. (D) Schematic representation of the morphology of maize leaf primordia from P1 to P5. (E) Schematic overview of the method for transverse section analysis of the maize leaf primordia. (1) Trim the older leaves with a wire stripper. (2) Measure the primordium and section the shoot. (3) Mount the section on a slide for imaging and processing (4, 5). (F) Schematic overview of the method for whole-mount analysis of the maize leaf primordia. (1) Remove the surrounding leaves to extract the primordium. (2) Cut and unroll the primordium flat on the nano tape. (3) Mount the sample for imaging and processing (4, 5). Abbreviations: L = leaf; bl = blade; sh = sheath; co = collar; me = mesocotyl; V = vegetative; P = plastochron; SAM = shoot apical meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autor em destaque: Métodos aprimorados para preparar seções transversais e montagens inteiras desenroladas de primórdios de folhas de milho para fluorescência e imagens confocais  

Métodos aprimorados para preparar seções transversais e montagens inteiras não enroladas de primordia de folhas de milho para fluorescência e imagens confocais

Grasses like maize have leaf primordia grow within the shoot, making them difficult to study. We address this problem with improved protocols for preparing maize leaf transverse sections and whole mounts for fluorescence and confocal imaging. The first protocol uses a wire stripper to cut the older leaves, allowing the measurement of the primordium prior to sectioning.The second protocol uses clear, double-sided nano tape to unroll whole leaf primordium. These protocols improve the accuracy of transverse sectioning and enable unrolling of the leaf primordia, which have been very difficult to achieve due to their rolled, conical morphology. These methods will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grasses.Based on these methods, we plan to develop live cell imaging strategies to address questions in grass leaf development.

Análise de secção transversal de primórdios foliares de milho Utilizou-se o protocolo seção 2 para quantificar o número de nervuras e caracterizar os padrões de resposta hormonal em cortes transversais de primórdios foliares de milho com FPs (Figura 4)24. Para avaliar o papel do hormônio vegetal auxina no crescimento foliar e na formação de nervuras, quantificamos o número de nervuras nos primórdios foliares de um mutante de milho deficiente em auxina, desaparecendo borlas254. Nos plastócronos iniciais, as nervuras em desenvolvimento exibem celularização distinta na camada celular mediana do primórdio foliar do milho21,22. No entanto, a identificação e contagem de veias utilizando técnicas histológicas convencionais22 pode ser trabalhosa e demorada. Assim, para quantificar as veias, utilizou-se o marcador da proteína de efluxo de auxina de milho p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (doravante PIN1a-YFP), que marca veias em desenvolvimento e fitas procambiais (PCSs; Figura 4A). Utilizando o protocolo seção 2, foi possível padronizar a amostragem do corte transversal medindo os primórdios antes do corte (Figura 4B,C). Descobrimos uma tendência em que vt2 tem um primórdio mais largo e mais nervuras do que o normal (Figura 4D,E)24, o que é consistente com dados de folhas totalmente expandidas55, indicando que o defeito em vt2 começou cedo no desenvolvimento foliar. Usando a seção 2 do protocolo, também pudemos examinar sistematicamente os padrões de expressão dos repórteres de resposta hormonal FP nos primórdios foliares (ver exemplos das imagens na Figura 4F-I). Através de um esquema padronizado de amostragem de seção transversal, mapeamos a distribuição das respostas de auxina, citocinina (CK) e ácido giberélico (GA) em diferentes plastochrons e regiões dos primórdios foliares, e descobrimos novos padrões de resposta que hipotetizamos ter implicações para o crescimento foliar e formação de nervuras24. Portanto, estes resultados representativos demonstram a utilidade do protocolo seção 2 para a análise de cortes transversais de primórdios foliares de milho.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> Figura 4: Resultados representativos da análise de secção transversal dos primórdios foliares do milho. (A-E) Quantificação do número de nervuras e largura do primórdio em primórdios foliares de borlas normais e desaparecidas2 com o marcador proteico de efluxo de auxina PIN1a-YFP. (A) Imagens representativas de fluorescência de cortes transversais de P5 a P7 expressando PIN1a-YFP em veias em desenvolvimento e fitas procambiais. Os cortes transversais foram fotografados com microscópio de epifluorescência usando filtro FITC (excitação de 495-519 nm). O número de veias e a largura do primórdio foram quantificados usando as ferramentas multiponto e linha livre em FIJI/ImageJ, respectivamente. (B) Uma plântula de milho com as espirais da folha superior removidas com um decapador de arame para expor a ponta da quarta folha (L4). O suporte abrange o comprimento do primórdio projetado, com a linha tracejada indicando o comprimento médio. (C) Diagrama esquemático de formas variadas de primórdio de P5 a P7, ilustrando como o número de veias e a largura do primórdio no comprimento médio (linha tracejada horizontal) podem variar dependendo do estágio de desenvolvimento do primórdio. (D,E) Medida da largura do primórdio (D) e do número de veias (E) na seção de comprimento médio da L4 normal e vt2. A linha de tendência representa médias contínuas de 10 mm das medidas ± erro padrão da média (EPM). (F-I) Imagens confocais representativas de seções transversais de primórdios foliares expressando combinações de PIN1a-YFP, auxin response reporter, DR5-RFP, cytokinin response reporter, TCS-Tomato, gibberellic acid-responsive marker, GAR2-YFP, e mDII-Venus, uma versão mutada do auxin signaling input reporter DII-Venus. Os canais FP são sobrepostos ao canal de campo brilhante em cada imagem. Barra de escala = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Esta figura foi modificada e reproduzida com permissão de Robil e McSteen24. Abreviações: DAG = dias após a germinação; P = plastocrono; vt2 = borla de desaparecimento2; PCS = fita procambial; YFP = proteína fluorescente amarela; FITC = isotiocianato de fluoresceína; RFP = proteína fluorescente vermelha; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomate = TCSv2::NLS-tdTomate; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Vênus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Análise de montagem integral de primórdios foliares de milho Seguimos o protocolo seção 3 para visualizar e analisar a expressão de PF em montagens de folhas inteiras de primórdios foliares de milho (Figura 5). Visualizando os padrões venosos com PIN1a-YFP, observamos que a formação de veias ocorre em todo o primórdio durante os plastócronos iniciais, mas esse processo torna-se restrito nas regiões proximais mais tarde no desenvolvimento (Figura 5A)24. Complementar às análises de secção transversal, as análises de montagem de folhas inteiras revelaram padrões de resposta hormonal tecidual e estádio-específica durante a formação da veia24. Um exemplo é o padrão de expressão do repórter de resposta CK TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato), relativo à expressão de PIN1a-YFP (Figura 5B)24. Seguindo o protocolo seção 3, pudemos realizar análises qualitativas e quantitativas da expressão de PF nos primórdios foliares (Figura 5D-F; dados não publicados). Examinamos os padrões de expressão de um repórter de resposta à auxina, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), e de um marcador responsivo a GA, p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), em montagens de folhas inteiras de mutantes simples e duplos de vt2 e planta anã3 (d3), um mutante56 deficiente em GA (Figura 5D). Também comparamos os níveis relativos de proliferação celular entre primórdios foliares normais e vt2 usando p Zm Ciclina-D2B::ZmCiclina-D2B:YFP42 (Ciclina-D2B-YFP), que é um marcador para a transição G1/S no ciclo celular57 (Figura 5E,F). Embora não tenha havido diferença significativa entre normal e vt2, a expressão de ciclina-D2B-YFP foi consistente com o conhecido perfil de proliferação celular dos plastochrons precoces31. Concluímos que o protocolo seção 3 é um método eficaz para analisar montagens inteiras de primórdios foliares de milho, que são difíceis de obter imagens devido à sua morfologia laminada.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> Figura 5: Resultados representativos da análise de montagem total dos primórdios foliares do milho. (A) Imagens representativas de fluorescência dos primórdios foliares de plântulas de milho 7 DAG mostrando nervuras em desenvolvimento e fitas procambiais, marcadas pelo marcador de proteína de efluxo de auxina PIN1a-YFP. Os primórdios P3-P6 foram retirados da base, desenrolados e achatados com o lado adaxial para cima. Insets mostram close-ups de P3 e P4. Em P5 e P6, linhas tracejadas demarcam a extremidade distal das zonas proliferativas, onde a maioria dos fios procambiais ainda está se desenvolvendo e se estendendo. (B,C) Imagens confocais representativas mostrando a expressão de PIN1a-YFP e do repórter de resposta de citocinina, TCS-Tomato, na região marginal proximal de um primórdio P5. (D) Imagens representativas de fluorescência de primórdios de P4 mostrando a expressão de repórter de resposta à auxina, DR5-RFP, e marcador responsivo ao ácido giberélico, GAR2-YFP em mutantes normais e simples e duplos de borlas em extinção2 e planta anã3. (E) Imagens confocais representativas de P3 e/ou P4 mostrando a expressão de Ciclina-D2B-YFP, um repórter para a transição G1/S no ciclo celular. (F) Quantidades relativas de proliferação celular nos primórdios foliares P3/P4 normal e vt2, quantificadas medindo-se a densidade integrada do sinal Cyclin-D2B-YFP sobre a área do primórdio usando ImageJ/FIJI. As barras representam as medidas médias ± erro padrão da média. Barra de escala = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B); 100 μm (C). A Figura 4A-C foi modificada e reproduzida com permissão de Robil e McSteen24, enquanto a Figura 4D-F é um dado não publicado dos autores. Abreviações: DAG = dias após a germinação; P = plastocrono; vt2 = borla em desaparecimento2; d3 = planta anã3; YFP = proteína fluorescente amarela; RFP = proteína fluorescente vermelha; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomate = TCSv2::NLS-tdTomate; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Ciclina-D2B-YFP = p Zm Ciclina-D2B::ZmCiclina-D2B:YFP; ns = sem diferença significativa; au = unidade arbitrária. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1: Exemplos de estadiamento do desenvolvimento foliar em mudas de milho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar S1: Amostras de plantas e materiais utilizados nos protocolos. (A,B) Uma plântula de milho 7-8 DAG com a folha superior removida usando um stripper de arame. (B) O inset mostra um close-up do broto com o perrodio P6 exposto. (C-G) Brotos de plântulas de milho com as espirais superiores removidas para análise de seção transversal (C,D) e folhas adjacentes totalmente removidas para análise de montagem total (E-G). (H) Um rolo de nanofita dupla face transparente de gel de poliuretano. (I,J) P6 primórdio da folha (I) e região proximal da folha P8 (J) desenroladas e montadas em lâminas de vidro com a nanofita. (K) Uma lâmina de vidro com um primórdio foliar não enrolado montada no palco de um microscópio de epifluorescência. Abreviação: DAG = dias após a germinação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Os primórdios das folhas de milho são profundamente embainhados e enrolados, tornando-os difíceis de estudar. Aqui, apresentamos métodos para preparar cortes transversais e montagens inteiras de primórdios foliares de milho para fluorescência e imagens confocais.

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

Gramíneas como o milho têm primórdios foliares crescendo dentro da parte aérea, tornando-os difíceis de estudar. Abordamos esse problema com protocolos aprimorados para preparar seções transversais de folhas de milho e montagens inteiras para fluorescência e imagens confocais. O primeiro protocolo utiliza um decapador de arame para cortar as folhas mais velhas, permitindo a medição do primórdio antes da secção.O segundo protocolo usa fita nano transparente de dupla face para desenrolar o primórdio da folha inteira. Esses protocolos melhoram a precisão da secção transversal e permitem o desenrolar dos primórdios foliares, que têm sido muito difíceis de serem alcançados devido à sua morfologia cônica laminada. Esses métodos serão úteis para visualizar e quantificar características anatômicas e de desenvolvimento foliar em milho e outras gramíneas.Com base nesses métodos, planejamos desenvolver estratégias de imagem de células vivas para abordar questões no desenvolvimento foliar de gramíneas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

1.8K visualizações.  Ateneo de Manila University. Gramíneas como o milho têm primórdios foliares crescendo dentro da parte aérea, tornando-os difíceis de estudar. Abordamos esse problema com protocolos aprimorados para preparar seções transversais de folhas de milho e montagens inteiras para fluorescência e imagens confocais. O primeiro protocolo utiliza um decapador de arame para cortar as folhas mais velhas, permitindo a medição do primórdio antes da secção.O segundo protocolo usa fita nano transparente de dupla face pa...

Vídeo: Autor em destaque: Métodos aprimorados para preparar seções transversais e montagens inteiras desenroladas de primórdios de folhas de milho para fluorescência e imagens confocais  

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study early leaf development. Here, we describe methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. The first method uses a wire stripper to remove the upper portions of older leaves, exposing the tip of the leaf primordium and allowing its measurement for more accurate transverse section sampling. The second method uses clear, double-sided nano tape to unroll and mount whole-leaf primordia for imaging. We show the utility of the two methods in visualizing and analyzing fluorescent protein reporters in maize. These methods provide a solution to the challenges presented by the distinctive morphology of maize leaf primordia and will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grass species.

Maize leaf primordia are deeply ensheathed and rolled, making them difficult to study. Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging.

Biologia

﻿Imaging Transverse Sections of Maize Leaf Primordia

Imaging Transverse Sections of Maize Leaf Primordia  

Begin by cutting the desired aged maize seedling at the mesocotyl tissue using a small knife or pair of scissors. Clean the seedling with a paintbrush. Then hold the wire stripper with its jaws facing the chute.Position the chute to the selected hole and squeeze the stripper handles together. Slide the stripper away from the chute to trim the upper portion of the leaves. Use a ruler to measure the length from the primordium's tip to the chute's base.To begin the leaf primordium imaging, hold the chute steady on a smooth surface under a stereo microscope at around 0.8x magnification. Using a razor blade or scalpel, make an initial cut slightly above the target region to discard the distal portion of the chute. Then obtain around 0.25 to 0.8 millimeter thin sections at the desired points along the length of the primordium.Once done, mount the leaf section on a clean glass slide. Apply a few drops of water directly to the section using a pipette. And place a cover slip on top.Apply a few more drops through the edges of the cover slip if needed. Place the slide on the epifluorescence microscope's stage and adjust the settings to visualize the fluorophore. Using this method, chance resection sampling was standardized by measuring the primordia prior to sectioning.A trend was discovered showing that the vanishing tassel two had a wider primordia and more veins than normal, indicating that the defect in the mutant began early in the leaf development. This method also enabled the systematic examination of the expression patterns of hormone response fluorescent protein reporters in the leaf primordia.

Imagem de seções transversais de Primordia foliar de milho

Imaging Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia

Begin the preparation of the glass slide by cutting a rectangular piece of clear, double-sided nano tape and sticking it to the center of a clean glass slide without removing the protective plastic film on the top side of the tape. Next, dissect the chute by removing the upper portion of the older leaves with a wire stripper. Then hold the chute by the mesocaudal and carefully remove the surrounding leaves with a dental probe to extract the primordia of interest.For mounting the primordium, remove the protective film from the tape. Lay the exposed primordium on the tape. Cut the primordium at the base using a razor blade, discarding the basal stem and the hypocaudal.For smoother unrolling, lubricate the inner, or, adaxial leaf surface by dipping the needle tip into 100%glycerol. Unroll the primordium using a dental probe with a bent needle. Position the needle tip parallel to the surface and unfurl the outer basal margin by gently pressing it against the tape.With the outer margin adhering to the tape, align the needle tip parallel to the long axis of the leaf. Gently slide the needle sideways to unroll and flatten the leaf onto the tape. Apply a drop of water to the unrolled primordium.Immediately place a cover slip on the water drop and the primordium. Gently press down the edges of the cover slip so that they adhere to the tape. Once done, place the slide on the epifluorescence microscope stage to visualize the fluorophore.This method was followed to visualize and analyze the fluorescent protein expression in maize leaf primordia. Complementary to the transverse section analysis. The whole leaf mount analysis revealed tissue and stage-specific patterns of formal response during vein formation.Whole mount analysis method enabled qualitative and quantitative analyses of fluorescent protein expression in the maize leaf primordia, indicating the effectiveness of this method in examining the maize leaf primordia which are difficult to image due to their rolled morphology.