Os autores são especialmente gratos a Deborah Harris e MacKay Danielle. Suporte para este trabalho foi fornecida pelo Departamento de Biologia e da Faculdade de Artes e Ciências de CWRU, e por HHMI número de concessão 52005866 para apoio ao ensino de graduação em ciências biológicas.

1. Metodologia de imagens <ol><li> Derreter a glicerina em uma geléia de 55 ° C banho de água grau por 20-30 minutos até que se torne um líquido homogêneo. Redemoinho, mas não agitar o frasco para evitar a formação de bolhas. </li><li> Enquanto a gelatina derrete, aplique uma camada fina de glicerol usando um Kimwipe em uma lâmina de vidro limpa (opcional). </li><li> Pipeta mL 1-1,5 de glicerina derretida geléia usando um corte de ponta da pipeta P1000 na superfície da lâmina para criar uma camada fina em primeiro lugar. Pipeta com cuidado para evitar bolhas. </li><li> Deixe a gelatina solidificar por 5 min em uma superfície horizontal, em seguida, coloque o slide a -20 ° C por 5 min e proceder ao alinhamento do embrião. Alternativamente, cobrir a lâmina com Saran Wrap e coloque-a 4 ° C por até 5 dias. </li><li> Pipetar uma pequena gota de embriões manchada em glicerol 70% / PBS ou outros Antifade glicerol baseada meios de montagem (por exemplo, ou Slowfade Vectashield) no lado da cama de geléia. </li><li> Começar a pré-alinhamento dos embriões por transferi-los individualmente a partir da queda para a superfície da geléia. Transferi-los usando uma agulha hipodérmica inclinada, usando o lado inclinado como uma colher. </li><li> Cerca de colocar os embriões ao longo de 2-3 colunas. Se um embrião fica preso na agulha, mexa na gota contendo os embriões outros para liberá-lo. Não perca tempo alinhando-as com cuidado neste momento. Deixe algum espaço entre as colunas. </li><li> Alinhar os embriões deslizando-los horizontalmente no meio de geléia com o auxílio da agulha hipodérmica. Enquanto desliza, orientar o cara e coroa na mesma direção. Torná-los paralelos um ao outro ao longo da coluna. Remover o excesso de glicerol PBS esquerda como uma trilha com um pedaço de Kimiwipe torcida. Nota: glicerol em excesso causará embriões para ser vagamente envolto em gel, resultando na separação das duas camadas de geléia, tornando-o difícil de cortar e montar. Por outro lado, a remoção de glicerol demais vai secar e alisar os embriões. </li><li> Use uma ponta de corte amarelo para espalhar uma fina camada de geléia sobre os embriões (50-150 mL, dependendo de quantas foram alinhados). </li><li> Slides lugar no freezer -20 ° C por 10-20 min ou guarde-a 4 ° C durante a noite. Certifique-se que a geléia é completamente rígida, antes de cortar. Caso contrário, o bloco de embriões será muito difícil especiais de consumo. Os melhores resultados são obtidos para o corte no dia seguinte. </li><li> De acordo com um escopo de dissecação, use uma lâmina de barbear para cortar completamente através da geléia de ambos os lados dos embriões alinhados. Segure a lâmina de barbear em um ângulo de 90 ° para fazer cortes retos. Os cortes devem ser feitos muito perto dos pólos anterior e posterior dos embriões para evitar o excesso de geléia que pode obstruir imagem. </li><li> Adicionar 100-200 mL de frio PBT (4 ° C, PBS 0,1% Tween 20) próximo aos cortes e com cuidado raspe a gelatina entre os embriões usando uma espátula. Nota: O detergente em PBT ajuda a remoção da geléia a partir do slide sem danificar embriões. </li><li> Usando uma agulha, transferir o bloco de geléia com embriões incorporados a um slide limpa para cortar ainda mais. Cortar blocos menores com embriões 5-7. Use PBT facilmente mover o bloco de gelatina. Alternativamente, coloque o bloco sobre uma superfície de vidro seco para deixá-lo ligar para o vidro, o que gera mais estabilidade para cortar precisamente a geléia, se necessário. </li><li> Virar na vertical os embriões embutido na geléia com o auxílio de uma lâmina de barbear e uma agulha. Para visualização no microscópio, prosseguir com qualquer uma das duas etapas abaixo, dependendo do tipo de microscópio estar sendo usado. </li><li> Microscópio invertido: lugar terminou blocos de embrião para uma lamela de comprimento, com embriões em posição vertical. Verifique se o lado do embrião com a menor quantidade de geléia estará em contato mais próximo com o objectivo. </li><li> Microscópio vertical: fazer duas pilhas com quatro # 1 lamínulas coladas com super cola para ser usado como &quot;suporte&quot; e colocar o bloco de embriões em glicerol entre as &quot;suporta&quot;. Ponte das pilhas usando uma lamela de comprimento. </li><li> Confocal para análise, verificar a distância de trabalho dos objectivos a ser usado para descobrir se você pode imaginar todo o caminho através do embrião ou apenas parcialmente. Por exemplo, D. embriões têm melanogaster ~ 0,55 milímetros de comprimento e pode ser inteiramente fotografada usando uma lente 20x Plano de Apo-ou 40x LD objetivo Neo-Fluor. O site a seguir tem informações sobre os objectivos Zeiss disponíveis e lhe dá a opção de pesquisar os objectivos de acordo com distâncias de trabalho: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Resultados representante Porque os embriões são deixados intactos, este método pode ser usado para fazer medições precisas de tamanho do embrião e as distâncias entre os padrões de expressão gênica. Na Figura 1, mostramos uma embriões blastoderma estágio manchadas com o DAPI nuclear mancha (azul), anti-dorsais proteína (vermelho), mRNA sog (amarelo) e mRNA sna (verde). Proces morfológicasses, como a invaginação do mesoderma (Figura 2A, B) e migração das células mesodérmica (Figura 3 e 4) também pode ser visualizado utilizando este método. Diferentes posições-Z ao longo do eixo DV podem ser obtidas alterando o plano focal, como mostrado nas Figuras 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Vertical óptico fatia de um embrião intacto em estágio blastoderma. Coloração duplo mRNA e proteína. MRNAs alvo para sondas em situ (sog e sna) e proteína manchada pelo anticorpo primário (anti-Dorsal) são indicadas na figura. DAPI foi usado para rotular os núcleos. Note-se que a expressão de sog e sna estão localizados no citoplasma apical, enquanto a expressão de dorsais é nuclear. Sinais fortes de transcrições sog nascentes que estão localizadas em núcleos também podem ser vistos sob esta ampliação. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Testes de imagem na vertical de um embrião intacto gastrulating. MRNA utilizados e suas respectivas cores são indicadas na figura. A) Note-se que nesta fase, três genes corados com fluor mesmo (sna, sog e dpp, em verde), são expressos em domínios separados espacialmente. A mesoderme invaginante expressa sna, a camada de neuroblastos expressa ind eo ectoderma expressa dpp, enquanto expressão sog ainda está presente nas regiões ventral do sistema nervoso. B) Em um plano mais profundo confocal do embrião mesmo, notamos a base do mesoderma invaginante fortemente expressa sna, mas a sua região apical expressa níveis mais baixos. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imagem na vertical de um embrião intacto com a banda de germe estendida sog RNA (amarelo);. Caracol, ind e mRNAs dpp (verde), proteína dorsais (vermelho). Núcleos foram corados com DAPI (azul). A) plano focal perto da cabeça do embrião. B) Outro plano focal na região do tronco de embrião. Nota massa de células antes da migração mesodérmica lateral (compare a Figura 4) deitado próximo à linha média ventral em ambos os lados de um embrião de germe de banda estendida. Neuroblastos delaminação são rotulados em verde (ind e sna). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Imagem na vertical de um embrião intacto durante a extensão banda germe sog RNA (amarelo);. Caracol, ind e mRNAs dpp (verde), proteína dorsais (vermelho). A) Observe o neuroblastos delaminação do epitélio (seta), manchado tanto para ind e sna nesta fase (verde). Note-se também a expressão restrito de sog à linha média ventral (amarelo). Expressão de dpp nesta fase pode ser visto em laterais do embrião (asterisco). B) seção Optical no embrião mesmo mostrado na A perto do final do comprimento do embrião, o que corresponde a mid-posterior região. As células da linha média ventral estão manchadas de sog.

<ol>
	<li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos.">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li><li>Gr&#946;hans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila.">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li><li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol.">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li><li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila.">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Obtenção de imagens seção transversal de embriões Drosophila pode ser um desafio, pois exige tanto uma dissecção cuidadosa das mãos de fatias 2 ou o uso de meios embutido para micrótomo de processamento, que normalmente é prejudicial para colorações fluorescentes. Alternativamente, Z-stacks feita em um microscópio confocal pode ser usado para fazer a reconstrução 3D de seção transversal imagens. No entanto, é demorado para fazer várias fatias finas de Confocal para uma reconstrução 3D preciso e torna-se problemático fotobranqueamento. Outra preocupação quando embriões de imagem que são montados longitudinalmente é o espalhamento de luz que ocorre quando chegar seções mais profundas do embrião, o que também complica a tomar medidas precisas de sinais fluorescentes para fins de quantificação dos níveis de proteína ou mRNA expressão 1. Mesmo com um microscópio de dois fotões confocal, espalhamento de luz ainda é uma preocupação devido à opacidade do material gema no meio do embrião, o que faz seleção de meios de montagem de transparência ideal da amostra a ser limitado. Para contornar esses problemas, uma nova técnica chamada &quot;End-on&quot; de imagens de embriões de posicionamento vertical foi recentemente desenvolvido para a imagem ao vivo e amostras fixas 4. Neste trabalho, desenvolvemos um novo protocolo para embriões montado verticalmente, que permite uma preparação simples e visualização de embriões fixo ou tecidos de qualquer tamanho e forma que são corados com múltiplas sondas situ 3. Nosso método consiste em utilizar uma mídia de montagem com consistência gelatinosa que é usado para envolver embriões alinhados dentro dele. Blocos cortados deste meios de montagem contendo embriões incorporado pode ser posicionada na vertical antes de imagens em qualquer tipo de microscópio confocal. Ao incorporar os embriões para a geléia e posicioná-los na vertical, somos capazes de tomar horizontal cross-seções usando microscopia confocal, em que as células ao longo do eixo dorsal-ventral do embrião são apresentados simultaneamente. Esta é uma melhoria significativa para fins de quantificação desde problemas de espalhamento de luz e fotodegradação de corantes fluorescentes que ocorre na reconstrução Z-stack convencional de embriões montado longitudinalmente agora são eliminados. Assim, a quantificação dos níveis de expressão de gene ou proteína ao longo do eixo dorsal-ventral é precisa, uma vez que as células localizadas na frente dorsal-ventral posições são gravadas ao mesmo tempo e, ao mesmo confocal Z-position. Além disso, o método descrito nos permite obter uma imagem 2-D completo ao longo do eixo dorsal-ventral de um embrião de 3-D sem o uso de complexos métodos computacionais unrolling para visualizar as células em diferentes posições ao longo do eixo DV 6. Alguns dos passos críticos incluem a remoção de glicerol em excesso após o alinhamento embriões, para evitar a divisão entre as duas camadas de geléia. No entanto, se a amostra é muito desidratado, a imagem resultante será disforme e têm morfologia incorreta. Além disso, se o meio de geléia de todo o embrião é cortado em um ângulo em vez de reto, a imagem resultante pode parecer menos redondo e mais ovular em forma, devido a um posicionamento incorreto dos embriões em um ângulo diferente de 90 graus. Finalmente, se a geléia não é cortado perto o suficiente para o embrião nas extremidades anterior / posterior, não é possível obter uma imagem apropriada porque a distância de trabalho o objetivo seria usado principalmente para se focalizar no jelly e não o embrião. Outro passo importante que pode ser necessária quando embrião imagem final gastrulating é cuidadosamente classificar os estágios de interesse no âmbito antes de alinhar-los. Normalmente, os embriões são encenadas de acordo com características morfológicas que podem ser mais facilmente reconhecida quando em uma posição longitudinal. Entre as modificações alternativa que pode ser feito com este método é incluir um reagente anti-fade (por exemplo, p-fenilenodiamina ou PPD) para a segunda camada de gelatina para ajudar a proteger contra a fotodegradação de corantes fluorescentes.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycerin Jelly mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences Company</td>
<td>17998-10</td>
<td>Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997.</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss LSM 700 Confocal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-544-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72204-02</td>
<td>Size 1 &frac12; (specific for the objectives used in this work).</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass cover slips (for making supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherfinest</td>
<td>12-544-10</td>
<td>Use four coverslips glued with superglue. </td>
</tr>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td>
<td>M420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Steel back single edge industrial blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>21-401-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hypodermic needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>1482610</td>
<td>26 Gauge</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

upright imaging of drosophila embryos

Vários gradientes conhecidos morfogenéticos e movimentos celulares ocorrem ao longo do eixo dorsal / ventral da<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrião. No entanto, as técnicas atuais usado para visualizar esses processos são um pouco limitadas. O protocolo a seguir descreve uma nova técnica para montagem fixa e rotulados<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões para visualização coronal com imagem confocal. Este método consiste em incorporar embriões entre duas camadas de mídia glicerina geléia de montagem, e as tiras de geléia de imagens posicionadas na vertical. O primeiro passo para imprensando os embriões é fazer uma cama fina de geléia de glicerina em um slide. Em seguida, os embriões são cuidadosamente alinhados nesta superfície e coberto com uma segunda camada de geléia. Após a segunda camada é solidificado, tiras de gelatina são cortadas e capotou na vertical para geração de imagens. Alternativas são descritas para visualizar os embriões, dependendo do tipo de stand microscópio para ser usado. Uma vez que todas as células ao longo do eixo dorsal-ventral são gravadas dentro de um único confocal Z-plano, o nosso método permite a medição precisa e comparação dos sinais fluorescentes sem fotobranqueamento ou espalhamento de luz comum para reconstruções em 3D de embriões montado longitudinalmente.

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Upright Imaging of Drosophila Embryos

Aqui apresentamos um protocolo de montagem para manchada<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões em posição vertical que permite que imagens de secções transversais através de microscopia confocal.

Imagem vertical de Drosophila Os embriões

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Upright Imaging of Drosophila Embryos

9.2K visualizações.  Case Western Reserve University. Aqui apresentamos um protocolo de montagem para manchada Drosophila Embriões em posição vertical que permite que imagens de secções transversais através de microscopia confocal.

Vídeo: Upright Imaging of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Biologia

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Colheita e Preparação Drosophila Os embriões para Gravação eletrofisiológicos e outros procedimentos

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Dissecação ao vivo de Drosophila Embriões: Métodos ágeis para Screening Coleções Mutant pela coloração de anticorpos

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo Centrifugação de Embriões Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Culturas de células primárias de Drosophila Os embriões Gástrula

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi Interferência por injeção dsRNA em Drosophila Os embriões

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imagem Alterar Forma Celular em Viver Drosophila Os embriões

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...