Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, NIDCD para M.H. (DC000088)

Todos os experimentos e procedimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e do National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e pelo National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e do National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health.
1. Eutanásia animal
<ol><li>Use camundongos transgênicos C57BL/6J ou Kcnj10-ZsGreen, dia pós-natal 30+ (P30+), que pesam entre 15-20 g.</li>
	<li>Eutanásia de um camundongo adulto (idade P30 ou mais) usando um protocolo aprovado (aqui asfixia por CO2 ). Execute a decapitação como uma etapa secundária. NOTA: Se a imunomarcação, alguns anticorpos podem ter sinal de fundo devido à ligação inespecífica ao sangue nos capilares da VS. A perfusão cardíaca com fixador pode resolver essa questão removendo o sangue dos capilares da VS. No entanto, a maioria dos anticorpos pode alcançar bons resultados sem esse método, e ele não será abordado neste protocolo.</li>
</ol>2. Expondo o labirinto ósseo
<ol><li>Limpe o rato pulverizando com etanol 70% e limpando com um papel toalha. Preste especial atenção à região da cabeça para reduzir o risco de contaminação. Remova a pele do crânio puxando a pele em direção ao nariz.</li>
	<li>Com uma tesoura afiada, divida o crânio ao longo do plano sagital médio para separar as porções esquerda e direita.</li>
	<li>Remova o cérebro do crânio para expor o labirinto ósseo.</li>
</ol>3. Extração da orelha interna
<ol><li>Identificar a orelha interna dentro do osso temporal (Figura 2A) e raspar os nervos cranianos com pinça #55. NOTA: O usuário deve estabilizar o espécime com sua mão não dominante usando um segundo conjunto de pinças #55. Diferentes áreas do espécime podem ser agarradas com a pinça estabilizadora durante toda a dissecção, se áreas críticas do espécime forem evitadas (por exemplo, não esmagar a cóclea).</li>
	<li>Usando pinças #55, disseque a bula e a cápsula, desprendendo-as do osso circundante. Remova qualquer tecido mole restante da superfície da orelha interna.</li>
	<li>Transfira o espécime para uma placa de cultura de tecidos transparente contendo 1x PBS fria (solução salina tamponada com fosfato), pH 7,4, e coloque sob um escopo de dissecção (Figura 2B).</li>
</ol>4. Dissecção VS
OBS: Com a prática, é possível dissecar o SV como uma peça longa que se assemelha a uma fita. O SV é frágil, portanto, se ele se quebrar em pedaços, estes podem ser armazenados juntos. Alternativamente, estes podem ser armazenados em poços rotulados separadamente de acordo com seu turno (por exemplo, basal, médio, apical).
<ol><li>Se as fontes de luz do escopo de dissecção puderem ser movidas, coloque uma luz acima da placa e a segunda fonte de luz do lado, paralela à superfície dissecante. Isso permite um melhor contraste do tecido sob o osso coclear.</li>
	<li>Com pinça #55, segure o espécime pela porção vestibular com a cóclea voltada para cima.</li>
	<li>Usando pinça #55, perfurar o osso coclear no ápice. NOTA: A pinça #5 é mais grossa que a #55 e pode ser usada para quebrar osso, mas o aumento do tamanho/força sacrifica a finura da pinça e a capacidade de manipular pequenos tecidos. Considere o uso de pinças feitas com um material como inox ou dumostar para evitar danos que podem ocorrer a pinças mais delicadas. Evite empurrar a pinça muito fundo sob o osso para evitar danificar a VS.</li>
	<li>Usando pinça #55, raspe ao longo da espira apical (Figura 2C), aplicando força suave para quebrar pequenos pedaços da camada óssea externa. Levante suavemente o osso e desconecte-o da parede lateral. NOTA: Pode ser útil pensar nesta dissecação como "remover tudo da VS", em vez de "dissecar a VS para fora da cóclea".</li>
	<li>Continuar usando pinça #55 para remover fragmentos de osso coclear das espiras apical e média (Figura 2D,E). Empurrar suavemente a parede lateral, fritar e remover os pedaços da parede óssea em direção à curva média para expor a parede lateral das espiras apical e média.</li>
	<li>Continuando usando pinça #55, empurre suavemente a parede lateral do giro apical para o lado para expor o gânglio espiral. Destacar-se a parede lateral das espiras apical e média do gânglio espiral ao longo da camada externa de células ciliadas. Remova pedaços de gânglio espiral de dentro da cóclea. NOTA: As pinças #55 são menores e oferecem uma vantagem ao manipular tecidos pequenos e delicados. Cuidados extras devem ser tomados para evitar dobrá-los ou danificá-los.</li>
	<li>Para melhor acesso à parede lateral do giro basal, desprenda a cóclea da porção vestibular do osso temporal utilizando pinça #55. Coloque a pinça #55 na janela redonda e oval e empurre para baixo em direção ao vestíbulo. A cóclea vai se destacar. Remova a porção vestibular da orelha interna.</li>
	<li>Continuando usando a pinça #55, agora remova pedaços de osso coclear basal, começando pela área do giro médio. Empurre suavemente a camada lateral da parede sob o osso para desprendê-lo.</li>
	<li>Remova a parte basal mais distante da parede lateral por meio de fritura e puxando suavemente o tecido. O osso nesta região pode ser muito espesso para ser removido sem danificar o tecido mole abaixo.</li>
	<li>Agora, com a parte basal da parede lateral descolada, separe o máximo possível da parede lateral da cóclea. Isso pode ser feito traçando a pinça #55 ao longo da parede lateral. Escove suavemente a pinça entre o osso e a parede lateral restante. Isso pode ser feito até o ápice em uma única peça, se o usuário for experiente. Mova a parede lateral para PBS fresco. NOTA: Embora pedaços maiores de VS possam ser mais fáceis de obter imagens, dada a natureza delicada dos tecidos, pedaços menores podem ser retirados (Figura 2F,G) e, dependendo do tamanho, também podem funcionar para aquisição de imagens.</li>
	<li>Use pinça #55 para colocar a parede lateral plana. A VS deve ser visível como uma camada mais escura de tecido no lado interno da parede lateral. NOTA: Os usuários podem encontrar, particularmente mais perto da extremidade apical, que parte do tecido da VS acidentalmente se desprende da parede lateral durante toda a dissecção.</li>
	<li>Delicadamente pincelar a camada do VS para descolá-la da parede lateral em sua extremidade basal (Figura 2H). Afastar suavemente o VS descolado e mover a pinça em direção à extremidade apical da parede lateral, desprendendo o VS como uma fita longa, se possível (Figura 2I). Não aperte o SV com pinça para puxá-lo. Se o tecido for muito frágil para ser agarrado, ele pode ser coletado alternativamente usando uma colher de tecido, como uma cureta de calázio. NOTA: A movimentação do SV deve ser sempre feita sob microscopia de luz para garantir que ele não seja perdido. Tenha sempre cuidado ao agarrar usando pinças devido ao risco de danos. Os usuários podem achar que o uso de cureta de calázio atenua o risco de danos ao tecido SV. Para sequenciamento de núcleo único, prossiga para a seção 5. Para imunomarcação de VS, prossiga para a seção 7.</li>
</ol>5. Suspensão de núcleo único SV
NOTA: Este protocolo é adaptado para tecido SV especificamente a partir de um protocolo de suspensão de núcleo único publicado pelo fabricante. Plataformas de diferentes fabricantes podem ser utilizadas31. Dada a variação específica da plataforma, recomenda-se rever o protocolo específico do fabricante fornecido com o equipamento. Para obter resultados ótimos para sNuc-Seq e minimizar a degradação do RNA, quanto mais rápida a dissecção do tecido, melhor (recomendado dentro de 15-20 min da eutanásia). Pode ser útil eutanasiar um animal de cada vez e somente quando estiver pronto para dissecar. Ter várias pessoas trabalhando simultaneamente nas dissecções também pode eliminar o tempo de degradação (por exemplo, um pessoal de laboratório trabalhando na orelha esquerda enquanto outro trabalha na orelha direita).
<ol><li>Se o tecido SV for usado para sNuc-Seq, colocar o tecido em tampão de lise refrigerado (Tris-HCl 10 mM, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, P40 nonidet 0,005% em água livre de nucleases). Observação : se o sequenciamento deve ser feito imediatamente após a dissecção, continue o protocolo. Se desejar pausar o protocolo, a preservação da VS é possível colocando-a em RNAlater. Conservar durante a noite a 4 °C, congelar rapidamente em azoto líquido e conservar a -80 °C até estar pronto a utilizar. Quando estiver pronto para uso, descongelar e lavar duas vezes em PBS por 5 min cada, em seguida, proceder à homogeneização (passo 5.2).</li>
	<li>Homogeneizar o tecido em homogeneizador de 2 mL com 10-20 golpes de gelo. NOTA: O cilindro de vidro entrará em contato manualmente com o fundo do tubo de vidro, fragmentando o SV. A VS é delicada, de modo que 20 golpes geralmente alcançam homogeneização bem-sucedida.</li>
	<li>Lise o tecido no gelo por 25 min. OBS: O tempo de lise varia de acordo com o tipo de tecido. Uma lise de 25 minutos no tecido da VS pode atingir uma baixa viabilidade celular (menos de 4%), mas o tempo pode ser adaptado se a viabilidade celular for muito alta (passo 5.8).</li>
	<li>Filtrar através de um filtro de 30 μm e girar o filtrado a 500 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1 mL de tampão de lavagem e ressuspensão dos núcleos (1x PBS, albumina de soro bovino [BSA] 1%, inibidor de RNase 0,2U/μL).</li>
	<li>Filtrar as células através de um filtro de 10 μm e centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retirar o sobrenadante e ressuspender em 50 μL de tampão de lavagem e ressuspensão dos núcleos.</li>
	<li>Conte os núcleos usando um contador de células e coloração azul de tripano. Diluir 5 μL da suspensão celular em 50 μL de 1x PBS para contagem celular; A viabilidade deve ser mínima (3%-4%) neste momento. Se a viabilidade for maior, adaptar o protocolo para a etapa 5.3 (lise) e padronizar o tempo de lise para garantir a lise adequada das células. NOTA: Uma alta viabilidade celular em uma única preparação de núcleo significa que há mais células intactas do que o desejado, e que a digestão adicional pode ser necessária.</li>
	<li>Carregue a amostra com a densidade nuclear desejada no aparelho/chip do fabricante (consulte o guia do fabricante). As capturas de núcleos únicos já estão prontas. NOTA: A partir de um camundongo adulto SV, geralmente são alcançados 50 μL da suspensão a uma concentração de 150.000 núcleos/mL.</li>
</ol>6. Sequenciamento de núcleo único da VS
<ol><li>Envie as amostras para a instalação principal para sequenciamento. NOTA: Esta parte do protocolo segue as etapas gerais de (1) geração de emulsão de contas de gel (GEM) e código de barras, (2) limpeza pós-GEM-RT e amplificação de cDNA, e (3) construção de biblioteca de expressão gênica 3'. O restante do protocolo sNuc-Seq é relativamente longo, e recomenda-se que os leitores usem seu protocolo específico do fabricante. O guia do fabricante provavelmente descreverá as etapas com detalhes específicos e imagens que o acompanham. Também pode haver vídeos de "como fazer" no site do fabricante. Os conjuntos de dados gerados podem ser representados de forma reduzida dimensionalmente, como uma aproximação e projeção de variedade uniforme (UMAP; Gráfico 3). Muitos laboratórios utilizam um núcleo de sequenciamento que pode executar esse protocolo para os usuários.</li>
</ol>7. Imunomarcação do VS e montagem tecidual
<ol><li>Se o tecido for usado para imunomarcação, transferi-lo para uma placa de 24 poços, submersa em 200 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% em 1x PBS, e incubar por 20 min à temperatura ambiente. NOTA: É útil realizar toda a remoção de líquido, lavagem e imunomarcação sob um microscópio. A visualização durante a pipetagem do tecido garantirá que ele não seja perdido acidentalmente durante a remoção do líquido. Os volumes dos anticorpos e lavagens podem ser ajustados desde que o volume seja grande o suficiente para submergir o tecido da VS dentro da solução.</li>
	<li>Após a etapa de fixação, remova o PFA realizando duas lavagens curtas em 1x PBS (aproximadamente 500 μL) a 4 °C por 5 min cada em um agitador orbital a baixa (30-50) RPM. Se armazenar, o tecido pode ser armazenado em 1x PBS a 4 °C.</li>
	<li>Remover o PBS e permeabilizar e bloquear por um mínimo de 1 h à temperatura ambiente em aproximadamente 300 μL de solução de PBS-T (0,05 Tween20 em 1x PBS com 10% de soro fetal bovino). NOTA: Os anticorpos primários e secundários devem ser diluídos nesta solução de bloqueio.</li>
	<li>Manchar o tecido com anticorpo primário de acordo com as especificações do anticorpo específico usado, geralmente durante a noite a 4 °C . Remova o PBS restante e adicione o anticorpo primário diluído. NOTA: A diluição deve ser escolhida com base nas sugestões do fabricante, dados publicados, experiência anterior, etc. Normalmente, a primeira concentração a ser testada é uma diluição de 1:100-200. Para o exemplo apresentado neste trabalho, os anticorpos GS-IB4 e DAPI foram diluídos a 1:200. Se houver coloração para mais de uma proteína, vários anticorpos primários podem ser combinados na mesma solução, desde que cada anticorpo primário tenha um hospedeiro diferente para evitar a reatividade cruzada de anticorpos secundários.</li>
	<li>Lave o anticorpo primário do tecido usando aproximadamente 500 μL de 1x PBS duas vezes por 10 min cada em um agitador orbital a baixas RPM. NOTA: Continue a garantir que o tecido SV esteja submerso na solução e não preso na lateral do poço.</li>
	<li>Coloração com um anticorpo secundário de acordo com as especificações do anticorpo específico usado, geralmente por 2 h à temperatura ambiente em um agitador orbital a baixas RPM. Cubra a placa de 24 poços para que o anticorpo secundário marcado fluorescentemente esteja protegido da luz. NOTA: Se for necessário mais de um anticorpo secundário, combine os anticorpos secundários na mesma solução. Certifique-se de evitar a rotulagem cruzada.</li>
	<li>Lave o anticorpo secundário do tecido usando aproximadamente 500 μL de 1x PBS quatro vezes por 5 min cada em um agitador orbital a baixas RPM. Mantenha a placa de 24 poços coberta para protegê-la da luz.</li>
	<li>Prepare a microlâmina maior (75 mm x 25 mm) colocando duas pequenas faixas de cola ao longo do eixo de 25 mm, um pouco menor do que a tampa de vidro menor de 18 mm x 18 mm. Coloque uma gota de reagente de montagem (aproximadamente 50 μL) entre as estrias de cola. NOTA: A cola cria uma pequena quantidade de espaço vertical para que, quando a segunda lamínula for colocada na parte superior, a amostra de tecido SV possa existir com segurança, mas continuar no lugar. Enquanto a espessura da estria é de 30-40 mícrons, a compressão do tecido entre as superfícies de vidro deve ser evitada para preservar a morfologia. Alternativamente, fita transparente também pode ser usada.</li>
	<li>Usando pinça #55, pegue o mínimo de tecido possível em uma extremidade da VS e transfira do PBS para a gota do reagente de montagem na microlâmina maior (75 mm x 25 mm). Coloque uma extremidade de uma tampa de vidro menor (18 mm x 18 mm) na lâmina onde uma faixa de cola foi colocada e solte suavemente para evitar a criação de bolhas de ar. A lamínula cairá para a outra faixa de cola e cobrirá o tecido SV.</li>
	<li>Sele o suporte passando uma gota de esmalte transparente em cada canto do suporte. Rotule o espécime de acordo com a tampa de vidro para longe do campo de visualização. Está pronto para a microscopia confocal (Figura 4).</li>
	<li>Visualize o tecido SV usando um microscópio de dissecção para garantir que ele esteja plano e não perto de bolhas de ar. Se o tecido SV não estiver orientado corretamente, o usuário pode tentar empurrar bolhas de ar para fora ou remover cuidadosamente a tampa de vidro menor e reposicionar o SV. Isso deve ser feito com cuidado para evitar quebrar as tampas de vidro.</li>
</ol>

Microdissecção da Estria Vascular para Sequenciamento de Núcleo Único ou Imunomarcação

<ol>
	<li>Bosher, S. K., Warren, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+electrochemistry+of+the+cochlear+endolymph+of+the+rat:+a+quantitative+study+of+its+electrical+potential+and+ionic+composition+as+determined+by+means+of+flame+spectrophotometry.">Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+irreversible+hearing+loss+is+caused+by+stria+vascularis+degeneration+in+an+Slc26a4-insufficient+mouse+model+of+large+vestibular+aqueduct+syndrome.">Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome.</a> Neuroscience. 310, 188-197 (2015).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rare+spindle+and+root+cell+transcriptional+profiles+in+the+stria+vascularis+of+the+adult+mouse+cochlea.">Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18100 (2020).</li><li>Gow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deafness+in+claudin+11-null+mice+reveals+the+critical+contribution+of+basal+cell+tight+junctions+to+stria+vascularis+function.">Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).</li><li>Chang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virally+mediated+Kcnq1+gene+replacement+therapy+in+the+immature+scala+media+restores+hearing+in+a+mouse+model+of+human+Jervell+and+Lange-Nielsen+deafness+syndrome.">Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).</li><li>Faridi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+and+phenotypic+spectra+of+KCNE1+deficiency+in+Jervell+and+Lange-Nielsen+Syndrome+and+Romano-Ward+Syndrome.">Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome.</a> Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).</li><li>Wangemann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+KCNJ10+protein+expression+abolishes+endocochlear+potential+and+causes+deafness+in+Pendred+syndrome+mouse+model.">Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model.</a> BMC Medicine. 2, 30 (2004).</li><li>Kitajiri, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+claudins,+tight+junction+adhesion+molecules,+in+the+inner+ear.">Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear.</a> Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).</li><li>Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+properties+of+cochlear+root+cells+are+consistent+with+roles+in+potassium+recirculation+and+spatial+buffering.">The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).</li><li>Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+in+the+stria+vascularis.">Tissue-resident macrophages in the stria vascularis.</a> Frontiers in Neurology. 13, 818395 (2022).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFA165+gene+therapy+ameliorates+blood-labyrinth+barrier+breakdown+and+hearing+loss.">VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss.</a> JCI Insight. 6 (8), e143285 (2021).</li><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+the+cochlear+intrastrial+fluid-blood+barrier+(review).">Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review).</a> Hearing Research. 338, 52-63 (2016).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+Meniere's+disease+targets+in+the+adult+stria+vascularis.">Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis.</a> Frontiers in Neurology. 12, 630561 (2021).</li><li>Fischer, J., Ayers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleus+RNA-sequencing:+how+it's+done,+applications+and+limitations.">Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).</li><li>Korrapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+and+single+nucleus+RNA-Seq+reveal+cellular+heterogeneity+and+homeostatic+regulatory+networks+in+adult+mouse+stria+vascularis.">Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316 (2019).</li><li>Pyle, M. P., Hoa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+single-cell+sequencing+for+the+field+of+otolaryngology:+A+contemporary+review.">Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review.</a> Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Shafer, M. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+analysis+of+single-cell+transcriptomic+data.">Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175 (2019).</li><li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-Seq+technologies+and+related+computational+data+analysis.">Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).</li><li>Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+and+spatial+transcriptomics+to+elucidate+intercellular+tissue+dynamics.">Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics.</a> Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).</li><li>Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+single-nucleus+RNA+sequencing+in+different+cell+types+and+tissues.">Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Antes do advento do sequenciamento de célula única, muitos pesquisadores usaram a análise de tecido em massa, que só tornou possível analisar transcriptomas médios entre células. Em particular, unicelular e sNuc-Seq permitiram isolar o transcriptoma de uma única célula ou núcleo único, respectivamente32. Nesse caso, transcriptomas de núcleo único podem ser identificados para células marginais, intermediárias e basais, bem como células fusiformes30. Isso perm...

A cóclea consiste de três câmaras cheias de líquido, a escala vestibular, a escala média e a escala timpânica. A escala vestibular e a escala timpânica contêm perilinfa, que apresenta alta concentração de sódio (138 mM) e baixa concentração de potássio (6,8 mM)1. A escala média contém endolinfa, que apresenta alta concentração de potássio (154 mM) e baixa concentração de sódio (0,91 mM)1,2,3. Essa diferença na concentração de íons pode ser chamada de potencial endococlear (PE), e é gerada primariamente pelo movimento de íons potássio através de vários canais iônicos e junções comunicantes na estria vascular (VS) ao longo da parede lateral da cóclea4,5,6,7,8,9,10,11 . A VS é um tecido heterogêneo, altamente vascularizado, que reveste a face medial da parede lateral da cóclea e contém três tipos celulares principais: células marginais, intermediárias ebasais12 (Figura 1).
As células marginais são conectadas por tight junctions para formar a superfície mais medial da VS. A membrana apical está voltada para a endolinfa da escala média e contribui para o transporte iônico de potássio para a endolinfa usando vários canais, incluindo KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 e Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. As células intermediárias são células pigmentadas que residem entre as células marginais e basais e facilitam o transporte de potássio através da VS utilizando KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. As células basais estão próximas à parede lateral da cóclea e estão intimamente associadas aos fibrócitos do ligamento espiral para promover a reciclagem de potássio da perilinfa12. A patologia da VS tem sido implicada em inúmeras afecçõesotológicas17,18. Mutações em genes expressos nos principais tipos celulares de VS, como Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 e Cldn11, podem causar surdez e disfunção de VS, incluindo a perda de PE19,20,21,22,23. Além dos três principais tipos celulares, existem outros tipos celulares menos estudados na VS, como as células fusiformes22, as células radiculares12,24, os macrófagos25, os pericitos26 e as células endoteliais27, que têm papéis incompletamente definidos envolvendo a homeostase iônica e a geração de EP28.
Em comparação com o sequenciamento de RNA em massa, o sequenciamento de RNA de núcleo único (sNuc-Seq) fornece informações sobre a heterogeneidade celular, em vez de uma média de RNAm em um grupo de células29, e pode ser particularmente útil ao estudar o SV30 heterogêneo. Por exemplo, o sNuc-Seq produziu uma análise transcricional que sugere que pode haver um papel das células fusiformes e radiculares na geração de PE, perda auditiva e doença de Ménière18. Uma caracterização transcricional adicional dos vários tipos de células da VS pode nos fornecer informações valiosas sobre a fisiopatologia subjacente aos diferentes mecanismos e subtipos de flutuação e perda auditiva relacionados à VS. A colheita dessas delicadas estruturas da orelha interna é de suma importância para a análise ótima dos tecidos.
Neste estudo, a abordagem de microdissecção para acessar e isolar a estria vascular da cóclea de camundongos adultos para sNuc-Seq ou imunomarcação é descrita. A dissecção do VS de camundongos adultos é necessária para entender vários tipos de células VS e caracterizar melhor seu papel na audição.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10-&#181;m filter (Polyethylenterephthalat)</td>
			<td >PluriSelect</td>
			<td >#43-50010-01</td>
			<td >Filter tissue during sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18 x 18 mm cover glass</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-541A</td>
			<td >Cover slip to mount SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30-&#181;m filter (Polyethylenterephthalat)</td>
			<td >PluriSelect</td>
			<td >#43-50030-03</td>
			<td >Filter tissue during sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide</td>
			<td >Daigger</td>
			<td >EF15978Z</td>
			<td >Microslide to mount SV on</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6J Mice</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td >RRID: IMSR_JAX:000664</td>
			<td >General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter</td>
			<td >Logos Biosystems</td>
			<td >L20001</td>
			<td >Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chalizon curette 5&#39;&#39;, size 3 2.5 mm</td>
			<td >Biomedical Research Instruments</td>
			<td >15-1020</td>
			<td >Used to transfer SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chromium Next GEM single Cell 3&#39; GEM Kit v3.1</td>
			<td >Chromium</td>
			<td >PN-1000141</td>
			<td >Generates single cell 3&#39; gene expression libraries</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear nail polish</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >NC1849418</td>
			<td >Used for sealing SV mount</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well</td>
			<td >Corning</td>
			<td >08-772B</td>
			<td >Culture dish used to hold specimen during dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D1306, RRID: AB_2629482</td>
			<td >Stain used for nucleus labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dounce homogenizer</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8938</td>
			<td >Used to homogenize tissue for sNuc-seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dumont #5 Forceps</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11252-30</td>
			<td >General forceps for dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dumont #55 Forceps</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11255-20</td>
			<td >Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >16000044</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glue stick</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >NC0691392</td>
			<td >Used for mounting SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GS-IB4 Antibody</td>
			<td >Molecular Probes</td>
			<td >I21411, RRID: AB-2314662</td>
			<td >Antibody used for capillary labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KCNJ10-ZsGreen Mice</td>
			<td >n/a</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl2</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >AM9530G</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mounting reagent</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#S36940</td>
			<td >Mounting reagent for SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Multiwell 24 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >#353047</td>
			<td >Plate used for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >AAJ216183</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nonidet P40</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >9-16-45-9</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease free water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >4387936</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital shaker</td>
			<td >Silent Shake</td>
			<td >SYC-2102A</td>
			<td >Used for steps of immunostaining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >J61196.AP</td>
			<td >Used for steps of immunostaining and dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNA Later</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >AM7021</td>
			<td >Used for preservation of SV for sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scizzors</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >14058-09</td>
			<td >Used for splitting mouse skull</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >15506017</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan blue stain</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween20</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >AAJ20605AP&#160;</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Microscope used for dissections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining

O potencial endococlear, gerado pela estria vascular, é essencial para manter um ambiente propício à adequada mecanotransdução das células ciliadas e, finalmente, à audição. Patologias da estria vascular podem resultar em diminuição da audição. A dissecção da estria vascular do adulto permite a captura focalizada de núcleo único e subsequente sequenciamento e imunomarcação de núcleo único. Essas técnicas são usadas para estudar a fisiopatologia da estria vascular em nível unicelular. 
O sequenciamento de núcleo único pode ser usado na análise transcricional da estria vascular. Enquanto isso, a imunomarcação continua a ser útil na identificação de populações específicas de células. Ambos os métodos requerem dissecção adequada da estria vascular como pré-requisito, o que pode revelar-se tecnicamente desafiador.

The cochlea consists of three fluid filled chambers, the scala vestibuli, scala media, and scala tympani. The scala vestibuli and scala tympani each contain perilymph, which has a high concentration of sodium (138 mM) and a low concentration of potassium (6.8 mM)1. The scala media contains endolymph, which has a high concentration of potassium (154 mM) and a low concentration of sodium (0.91 mM)1,2,3. This difference in ion concentration can be referred to as the endocochlear potential (EP), and is primarily generated by the movement of potassium ions through various ion channels and gap junctions in the stria vascularis (SV) along the lateral wall of the cochlea4,5,6,7,8,9,10,11. The SV is a heterogenous, highly vascularized tissue that lines the medial aspect of the lateral wall of the cochlea and contains three main cell types: marginal, intermediate, and basal cells12 (Figure 1).
Marginal cells are connected by tight junctions to form the most medial surface of the SV. The apical membrane faces the endolymph of the scala media and contributes to potassium ion transport into the endolymph using various channels, including KCNE1/KCNQ1, SLC12A2, and Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. Intermediate cells are pigmented cells that reside between marginal and basal cells and facilitate potassium transport through the SV using KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Basal cells lie in close proximity to the lateral wall of the cochlea and are closely associated with fibrocytes of the spiral ligament to promote potassium recycling from the perilymph12. Pathology of the SV has been implicated in numerous otologic disorders17,18. Mutations in genes expressed in the major SV cell types, such as Kcnq1, Kcne1, Kcnj10, and Cldn11, can cause deafness and SV dysfunction, including the loss of EP19,20,21,22,23. In addition to the three major cell types, there are other less-studied cell types in the SV, such as spindle cells22, root cells12,24, macrophages25, pericytes26, and endothelial cells27, that have incompletely defined roles involving ionic homeostasis and the generation of EP28.
In comparison to bulk RNA-sequencing, single-nuclei RNA-sequencing (sNuc-Seq) provides information about cell heterogeneity, rather than an average of mRNA across a group of cells29, and can be particularly useful when studying the heterogenous SV30. For example, sNuc-Seq has produced transcriptional analysis that suggests there may be a role for spindle and root cells in EP generation, hearing loss, and Meniere&#39;s disease18. Further transcriptional characterization of the various SV cell types can provide us with invaluable information on the pathophysiology underlying different mechanisms and subtypes of SV-related hearing fluctuation and hearing loss. The harvest of these delicate inner ear structures is of paramount importance to optimal tissue analysis.
In this study, the microdissection approach to access and isolate the stria vascularis from the adult mouse cochlea for sNuc-Seq or immunostaining is described. Dissection of the adult mouse SV is required to understand various SV cell types and further characterize their role in hearing.

Autor em destaque: Dissecção de estria vascular de camundongo adulto para sequenciamento de núcleo único ou imunocoloração  

Dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação

The stria vascularis functions to generate the endocochlear potential and regulate ion homeostasis in the cochlea. The auditory development and restoration program seeks to understand the underlying mechanisms connecting dysfunctional ion homeostasis with hearing and stability disorders, which are diseases where either fluctuation in or sudden hearing loss occurs. Work in my lab has established the transcriptional landscape of the stria vascularis and has contributed to our understanding of its importance in hearing.We have used these data to draw parallels to poorly-understood hearing and stability disorders, including Meniere's disease. This protocol enables the dissection and isolation of whole-mount stria vascularis for further molecular studies including immunohistochemistry. Given that stria vascularis cell types are intricately intertwined with one another, the use of nuclear isolation and single-nucleus RNA sequencing has facilitated our understanding of the distinct transcriptional machinery involved.

Apresentamos um método para isolar o VS a ser usado para sNuc-Seq ou imunomarcação. A anatomia relevante (Figura 1) da cóclea em relação à VS pode ajudar o usuário a entender melhor a organização da VS e as etapas do protocolo de dissecção.
Cada passo dessa microdissecção de VS de um mouse P30 é detalhado no vídeo associado, e instantâneos dos principais passos dessa dissecção e isolamento de VS são apresentados na Figura 2...

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A estria vascular é vital para a geração do potencial endococlear. Apresentamos aqui a dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação.

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell ...

A estria vascular tem a função de gerar o potencial endococlear e regular a homeostase iônica na cóclea. O programa de desenvolvimento e restauração auditiva busca compreender os mecanismos subjacentes que ligam a homeostase iônica disfuncional com os distúrbios da audição e estabilidade, que são doenças em que ocorre flutuação ou perda auditiva súbita. O trabalho em meu laboratório estabeleceu a paisagem transcricional da estria vascular e contribuiu para a compreensão de sua importância na audição.Usamos esses dados para traçar paralelos com distúrbios auditivos e de estabilidade mal compreendidos, incluindo a doença de Ménière. Este protocolo permite a dissecção e o isolamento da estria vascular de toda a montaria para estudos moleculares posteriores, incluindo imunohistoquímica. Dado que os tipos celulares da estria vascular estão intrinsecamente entrelaçados entre si, o uso de isolamento nuclear e sequenciamento de RNA de núcleo único facilitou nossa compreensão da distinta maquinaria transcricional envolvida.

dissection-adult-mouse-stria-vascularis-for-single-nucleus-sequencing

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

1.3K visualizações.  National Institutes of Health. A estria vascular tem a função de gerar o potencial endococlear e regular a homeostase iônica na cóclea. O programa de desenvolvimento e restauração auditiva busca compreender os mecanismos subjacentes que ligam a homeostase iônica disfuncional com os distúrbios da audição e estabilidade, que são doenças em que ocorre flutuação ou perda auditiva súbita. O trabalho em meu laboratório estabeleceu a paisagem transcricional da estria vascular e contribuiu para a compreensão de su...

Vídeo: Autor em destaque: Dissecção de estria vascular de camundongo adulto para sequenciamento de núcleo único ou imunocoloração  

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell mechanotransduction and ultimately hearing. Pathologies of the stria vascularis can result in a decreased hearing. Dissection of the adult stria vascularis allows for focused single-nucleus capture and subsequent single-nucleus sequencing and immunostaining. These techniques are used to study stria vascularis pathophysiology at the single-cell level. 
Single-nucleus sequencing can be used in the setting of transcriptional analysis of the stria vascularis. Meanwhile, immunostaining continues to be useful in identifying specific populations of cells. Both methods require proper stria vascularis dissection as a prerequisite, which can prove to be technically challenging.

The stria vascularis is vital to the generation of endocochlear potential. Here, we present the dissection of the adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining.

Biologia

Mouse Inner Ear Extraction and Stria Vascularis Dissection

To begin, identify the inner ear within the temporal bone of a euthanized mouse. Scrape away the cranial nerves using number 55 forceps. Then use number 55 forceps to dissect out the bulla and capsule, detaching them from surrounding bone.Remove any remaining soft tissue from the inner ear surface. For SV dissection, use number 55 forceps to hold the specimen by the vestibular portion with the cochlear facing up. Pierce through the cochlear bone at the apex using the same forceps.Scrape along the apical turn, applying gentle force to break away small pieces of the outer bone layer. Gently lift the bone and detach it from the lateral wall. Using number 55 forceps remove cochlear bone pieces from the apical and middle turns.Gently pushing down the lateral wall, pry and remove the bone wall pieces towards the middle turn to expose the lateral wall of the apical and middle turns. Push the apical turn lateral wall aside to expose the spiral ganglion. Detach the lateral wall of the apical and middle turns from the spiral ganglion along the outer hair cell layer.Then remove pieces of spiral ganglion from inside the cochlear. Detach the cochlear from the vestibular portion of the temporal bone by inserting the forceps into the round and oval window and pushing down towards the vestibule to have better access to the lateral wall of the basal turn. After the cochlear is detached remove the vestibular portion of the inner ear.Prioritize preserving as much of the strayer as possible. Continue removing til the bone of the middle turn is detached from the SV.Next, remove pieces of the remaining cochlear bone covering the basal turn. This can be accomplished by pushing the lateral wall layer under the bone to detach it.Pry and gently pull the tissue to remove the farthest basal part of the lateral wall being careful not to damage the soft tissue below. With the basal part of the lateral wall detached, separate the lateral wall from the remaining cochlear by tracing the forceps along the lateral wall. Gently brush the forceps between the bone and the remaining lateral wall until it reaches the apex.Then move the lateral wall to a fresh PBS. Lay the lateral wall flat revealing the SV as a darker layer of tissue on the internal side of the lateral wall. Gently pry the SV layer away from the lateral wall.Push aside the detached SV and advance the forceps along the lateral wall attempting to detach the SV as one long ribbon, trying not to squeeze the SV.Use a tissue scoop to collect the fragile tissue. Cochlear were dissected from adult mouse aged greater than or equal to postnatal day 30. Inner ear was extracted from the surrounding temporal bone.SV was exposed after the removal of bone covering the middle turn. The SV was fully separated from the lateral wall after dissection.

Extração da orelha interna de camundongos e dissecção da estria vascular

Preparation of Stria Vascularis Single-Nucleus Suspension

Homogenize the dissected stria vascularis tissue from mouse ear in a two-milliliter Dounce homogenizer, with 10 to 20 strokes on ice. Lyse the tissue on ice for 25 minutes. Then, filter the tissue through a 30-micron filter and spin the filtrate at 500G for five minutes at four degrees Celsius.Remove the supernatant and resuspend the cell pellet in one milliliter of nuclei wash and resuspension buffer. Next, filter the cells through a 10-micron filter and centrifuge at 500G for five minutes at four degrees Celsius. Remove the supernatant and resuspend in 50 microliters of nuclei wash and resuspension buffer.After Trypan Blue staining, dilute five microliters of the cell suspension into 50 microliters of 1X PBS and count the cells. To prepare single nuclei captures, load the sample with the desired nuclear density onto the chip.

Preparo da Suspensão de Núcleo Único da Estria Vascular

Immunostaining of Mouse Stria Vascularis and Tissue Mounting

Prepare for immunostaining by dissecting the stria vascularis from the mouse and add the tissue to a 24-well plate containing 200 microliters of 4%paraformaldehyde in 1X PBS. Incubate the tissue for 20 minutes at room temperature. perform two short washes of 1X PBS on an orbital shaker at low RPM.Remove the PBS, then perform permeabilization and blocking for a minimum of one hour at room temperature in 300 microliters of PBST solution. Next, stain the tissue with the primary antibody overnight at four degrees Celsius. Then add a secondary antibody and incubate for two hours at room temperature on an orbital shaker at low RPM.Cover the plate to protect the fluorescently tagged secondary antibody from light. Next, prepare a larger microslide by placing two small streaks of glue along the 25 mm axis, just smaller than the 18 by 18 millimeter glass cover slip. Place one drop of mounting reagent between the glue streaks.Using number 55 forceps, gab as little tissue as possible on one end of the SV, and transfer it from PBS to the mounting reagent. Place one end of the cover slip on the slide where one streak of glue was placed. Then gently release the cover slip to avoid creating air bubbles.Seal the mount by dabbing a drop of transparent nail polish on each corner of the mount. Label the specimen on the glass cover slip, away from the visualization field. Visualize the SV tissue under a dissection microscope to ensure it is lying flat and not near any air bubbles.If the SV tissue is not oriented correctly, try to push out air bubbles or carefully remove the smaller glass cover slip and reposition the SV.A whole mount of SV from P30 mouse was prepared and confocal imaging was performed. ZsGreen expression was observed in the intermediate cells, GSIB4 labeled endothelial cells, and DAPI labeled the nuclei.