Este estudo foi financiado por bolsas da Fundação de Ciências Naturais da China (3157270). Agradecemos ao Dr. Feng Shao (Instituto Nacional de Ciências Biológicas, China) por fornecer o iBMDM.

1. Isolamento de pequenas vesículas extracelulares
NOTA: Efectuar toda a centrifugação nos passos 1.1-1.11 a 4 °C.
<ol><li>Preparação de soro fetal bovino (FBS) livre de sEVs: Centrifugar FBS durante a noite a 110.000 × g a 4 °C através de uma ultracentrífuga (ver Tabela de Materiais) para remover sEVs endógenos. Recolher o sobrenadante, filtrar, esterilizar-lhe com uma membrana de ultrafiltração de 0,2 μm e armazená-lo a -20 °C.</li>
	<li>Placa cerca de 3 x 107 macrófagos imortalizados derivados da medula óssea (iBMDMs) em uma placa de cultura de 150 mm e adicionar 20 mL de meio de cultura DMEM (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Antes de coletar sEVs, descarte o meio. Lave as células uma vez com PBS (solução salina tamponada com fosfato; Tabela de Materiais) e substituí-lo por um meio contendo 10% de SFB livre de sEVs.</li>
	<li>De acordo com as necessidades do experimento, coletar o sobrenadante celular e transferi-lo para tubos centrífugos de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar o sobrenadante celular a 300 × g por 10 min para remover as células, descartar o pellet e transferir o sobrenadante para novos tubos centrífugos de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar o sobrenadante a 2000 × g durante 10 minutos para remover as células mortas, eliminar o pellet e transferir o sobrenadante para novos tubos de centrífuga de alta velocidade (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Centrifugar o sobrenadante a 10.000 × g por 30 min através de uma centrífuga de alta velocidade para remover restos celulares e microvesículas, descartar o pellet e transferir o sobrenadante para novos tubos ultracentrífugos (ver Tabela de Materiais). O volume dos tubos de ultracentrífuga abertos é de 38,6 mL; colocar 35 mL de sobrenadante celular em cada tubo.</li>
	<li>Centrifugar o sobrenadante a 110.000 × g por 70 min em uma centrífuga de rotor de caçamba oscilante (ver Tabela de Materiais) para obter pellet de sEV bruto.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante e lave o pellet enriquecido com sEVs com 1 mL de PBS. Centrifugar a 110.000 × g por 70 min em uma ultracentrífuga de mesa (consulte Tabela de Materiais). Eliminar o sobrenadante e adicionar 1 ml de PBS a um tubo de ultracentrífuga.</li>
	<li>Em seguida, pipetar o precipitado continuamente, transferir o 1 mL de PBS para outro tubo de ultracentrífuga, e assim por diante, até que todos os tubos de ultracentrífuga sejam misturados por pipetagem.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 μL de PBS, que é sEVs.</li>
	<li>Medir a proteína total de sEVs usando o método do Ácido Biconínico (BCA), seguindo as etapas abaixo (ver Tabela de Materiais).<ol><li>Preparação do padrão proteico: Adicionar 1,2 ml de solução de preparação proteica num tubo de proteína padrão (30 mg de BSA) para dissolver completamente e preparar a solução-padrão proteica (25 mg/ml). Em seguida, diluir com PBS até uma concentração final de 0,5 mg/mL.</li>
		<li>Adicionar 0 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL, 8 μL, 12 μL, 16 μL e 20 μL do padrão proteico na placa de 96 poços e adicionar PBS para perfazer 20 μL. Ao mesmo tempo, adicionar 18 μL de tampão de lise HEPES (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF, 0,5% Triton X-100) e 2 μL de amostras de sEVs aos poços de amostra a serem testados.</li>
		<li>Prepare a solução de trabalho BCA necessária de acordo com as instruções do fabricante, adicione 200 μL de solução de trabalho BCA a cada poço e coloque à temperatura ambiente (RT) por 20-30 min.</li>
		<li>Medir a absorbância no comprimento de onda de 562 nm com um leitor de microplacas e calcular a concentração de proteína total dos sEVs de acordo com a curva padrão e o fator de diluição. NOTA: Os sEVs extraídos de 40 mL de sobrenadante por este protocolo podem ser utilizados para posterior identificação de marcadores proteicos (western blot). No entanto, sEVs extraídos de 200 mL de sobrenadante celular podem ser usados tanto para observação morfológica (microscopia eletrônica de transmissão, MET) quanto para análise granulométrica (análise de rastreamento de nanopartículas, NTA). Especificamente, para sEVs colhidos na etapa 1.11, ressuspender com 100 μL de PBS. Tomar 20-30 μL para observação morfológica (MET) e ressuspender a amostra restante em 1 mL PBS para análise granulométrica (NTA). Todas as centrífugas são pré-resfriadas com antecedência. Para a etapa 1.8, estes tubos ultracentrífugos devem ser rigorosamente equilibrados e pelo menos três quartos cheios. Caso contrário, adicione meio à maquiagem. Para a etapa 1.11, os sEVs podem ser armazenados a 4 °C por um curto período (12 h); caso contrário, devem ser armazenados a -20 ou -80 °C para evitar degradação proteica que interfira na extração de peptídeos. No entanto, para amostras usadas para observar a morfologia e medir o tamanho das partículas, recomenda-se apenas armazenar a 4 °C por um curto período de tempo (12 h).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Observação da morfologia de sEVs por microscopia eletrônica de transmissão
<ol><li>Coloque uma gota de amostra de sEVs frescos (cerca de 20-30 μL) no parafilme, coloque o lado do número da malha de cobre na gota de sEVs e deixe absorver por 3 min.</li>
	<li>Absorva o excesso de líquido com papel de filtro e, em seguida, coloque a grade de cobre em uma gota de água destilada e lave-a duas vezes.</li>
	<li>Absorva o excesso de líquido com papel de filtro. Em seguida, coloque a grade de cobre sobre a gota de acetato de uranila a 0,5% para coloração negativa por 5 s.</li>
	<li>Repita a etapa 2.2.</li>
	<li>Colocar a malha de cobre preparada na haste da amostra e inseri-la na fase de amostragem.<ol><li>Ajuste a ampliação para 20.000x-25.000x para encontrar a amostra a ser testada. Em seguida, ajuste a ampliação para 100.000x e ajuste a posição apropriada e escala de cinza para observar sob um microscópio eletrônico de transmissão (MET; Tabela de Materiais). A tensão de aceleração para aquisição de imagens é ajustada em 80 kV. NOTA: Para a etapa 2.1, se a concentração das amostras de sEVs for baixa (<50 μg/μL), o tempo de adsorção pode ser estendido para 5 min ou até mais. Alternativamente, para o passo 1.10, um volume menor de PBS (50 μL) pode ser usado para ressuspensão. Para o passo 2.3, o tempo de coloração negativa não deve ser muito longo; caso contrário, é difícil observar a estrutura tridimensional (3D) dos sEVs.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Medidas de distribuição granulométrica e concentração de sEVs por análise de rastreamento de nanopartículas
<ol><li>Para os sEVs colhidos na etapa 1.11, diluir a solução em 1 mL para análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Primeiro, limpe o instrumento com água destilada até que não haja impurezas no campo de visão. Em seguida, use uma seringa estéril de 1 mL para empurrar a amostra lentamente (volume de injeção: 0,5-1 mL).</li>
	<li>Analise as amostras através de software de suporte (consulte Tabela de Materiais). Especificamente, clique em Iniciar câmera e ajuste o nível da câmera para um tamanho apropriado (geralmente uma intensidade de 14 a 16 unidades), selecione o método de medição, Medição padrão (3 ou 5 vezes) e clique em Executar para coletar as partículas.</li>
	<li>Depois de coletar as partículas, o computador pode observar as partículas de sEVs em movimento. Ao mesmo tempo, defina o limiar de detecção (geralmente 5) para analisar a distribuição do tamanho das partículas de modo que as partículas finais contadas sejam todas sEVs em movimento em vez do fundo. Depois de analisar as partículas, salve e exporte os resultados da análise.</li>
	<li>Após o uso, lave o instrumento com água destilada até que não haja partículas óbvias no campo de visão e desligue o laser. NOTA: Ao contrário das amostras de sEVs para MET, as amostras de sEVs para NTA não devem ser muito concentradas e requerem volumes de amostra maiores (pelo menos 1 mL). Além disso, métodos alternativos podem ser usados para analisar a distribuição de tamanho de sEVs, como citometria de fluxo e sensor de pulso resistivo ajustável (TRPS), etc. O número recomendado de partículas/quadros para medições de NTA (NanoSight LM10) é de 40.</li>
</ol>4. Detecção de marcadores proteicos de sEVs por western blot
NOTA: De acordo com as diretrizes Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV) 201817,18, 5 categorias de proteínas são recomendadas para a caracterização de sEVs. Avaliar pelo menos um marcador proteico de cada categoria 1 a 4 para a preparação de sEVs.
<ol><li>Para os sEVs colhidos na etapa 1.9, pipetar cuidadosamente o sobrenadante e adicionar 15 μL de tampão de lise HEPES por 5 min. Em seguida, adicione uma quantidade igual de tampão de carga e cozinhe em água fervente por 15 min.</li>
	<li>Nesse protocolo, a carga de proteína dos sEVs foi de 8-10 μg. Eletroforese as proteínas em géis a 10% a uma tensão constante de 80 V (cerca de 30 min).<ol><li>Quando a amostra entrar no gel separador, ajuste a tensão para 120 V (cerca de 45 min). Depois que a amostra estiver a 2-3 cm de distância do fundo da placa de vidro, desconecte a fonte de alimentação e corte a tira de amostra para eletroporação. A composição da solução de electroforese é descrita na sub-etapa 4.2.1.1.<ol><li>Para preparar a solução de eletroforese 5x, pesar 15,1 g, 5 g e 94 g de Tris, SDS e glicina, respectivamente, e diluir para 1 L com água deionizada. Quando é usado, precisa ser diluído 5 vezes com água.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Montar o dispositivo de eletroporação e colocar em solução de eletroporação suficiente (cerca de 1 L), e eletroporar a proteína na membrana de nitrocelulose (NC) com uma corrente constante de 90 mA sobre gelo por 3,5 h. OBS: Para preparar 10x solução de eletroporação, pesar 30,25 g e 144,1 g de Tris e glicina, respectivamente, e diluir para 1 L com água deionizada. Quando utilizado, precisa ser preparado na proporção de 7:2:1 de água deionizada: metanol: solução de eletroporação.</li>
	<li>Após a eletroporação, colocar a membrana NC em solução de bloqueio (2,5 g de leite em pó desnatado em 50 mL de solução salina tamponada com Tween 20 a 0,1% (TBST) por 1-2 h no TR ou durante a noite a 4 °C. A composição do TBST é descrita na subetapa 4.4.1.<ol><li>Para preparar 10x TBST, pesar 60,56 g e 175,32 g de Tris e NaCl, respectivamente, e adicionar 10 mL de Tween-20 e 34 mL de ácido clorídrico concentrado. Ajustar o pH = 7,6 com ácido clorídrico concentrado e maquiar para 2 L com água deionizada. Quando é usado, precisa ser diluído dez vezes com água.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificar os marcadores proteicos por três marcadores de sEVs (cluster de diferenciação 9 [CD9]; β-actina; gene de suscetibilidade tumoral [TSG101]) e um marcador de não-sEVs (proteína regulada por glicose 94 [GRP94]).<ol><li>Pipetar 2 μL dos anticorpos acima e diluir a 1:500, em seguida, incubar as membranas NC em RT por 3 h ou durante a noite a 4 °C. O diluente é a solução de bloqueio do passo 4.4.</li>
		<li>Após a incubação com o anticorpo primário, lavar 3 vezes com 1x TBST em um agitador por 10 min de cada vez.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque a membrana NC no anticorpo secundário diluído (1:500) e agite lentamente em um agitador em RT por 45-50 min. Lave-o 3 vezes com 1x TBST em um agitador por 10 min de cada vez.</li>
	<li>Misturar os substratos quimioluminescentes A e B (ver Tabela de Materiais) a 1:1, adicionar o reagente misto à membrana NC e incubar em RT por 5 min.</li>
	<li>Imagem da membrana NC usando um imageador de manchas (consulte Tabela de Materiais)<ol><li>Abra o software Image Lab e selecione Novo Protocolo Experimental.</li>
		<li>Selecione o aplicativo Blotting-colorimetric, cancele Highlight, clique em Run Experimental Protocol, adquira o marcador e salve-o.</li>
		<li>Em seguida, selecione novamente o programa de aplicação Blotting-chemi e defina o Número total de imagens e o Tempo de exposição para 30 s e 300 s, respectivamente.</li>
		<li>Clique em Executar Protocolo Experimental, adquira as imagens e salve-as. Finalmente, remova a membrana NC e desligue o computador. NOTA: Para a etapa 4.6, o tempo de incubação do anticorpo secundário não deve exceder 50 min; caso contrário, o fundo será muito escuro.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Extração de peptídeos de sEVs
<ol><li>Lavar os sEVs duas vezes por ultracentrifugação a 110.000 × g a 4 °C por 70 min, adicionar 500 μL de PBS (ver Tabela de Materiais) para ressuspendê-los e adicionar 5 μL de inibidor de protease 100x (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Coloque a amostra para trituração ultra-sônica (consulte Tabela de Materiais). As configurações para homogeneização ultra-sônica são as seguintes: potência: 40 W, tempo total: 10 min, tempo ultra-sônico: 3 s e tempo de intervalo: 5 s.</li>
	<li>Centrifugar a mistura triturada a 13.700 × g durante 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Após centrifugação, adicionar ditiotreitol (TDT; Tabela de Materiais) ao sobrenadante até uma concentração final de 50 mmol/L e incubar em banho-maria a 56 °C durante 30 min.</li>
	<li>Em seguida, adicionar 50 μL de iodoacetamida (IAA; Tabela de Materiais) ao sobrenadante na concentração de 1 mol/L e deixá-lo reagir em TR por 20 min no escuro.</li>
	<li>Centrifugar a mistura a 13.700 × g a 4 °C durante 15 minutos e recolher o sobrenadante, o extracto bruto dos péptidos. Conservar a -20 °C para utilização posterior.</li>
	<li>Ultrafiltrar os peptídeos obtidos extrato bruto com tubos de ultrafiltração de 10 kDa19 (ver Tabela de Materiais) para remover proteínas, e centrifugar a 13.700 × g a 4 °C por 1 h. Recolher o efluente e secá-lo num concentrador centrífugo a vácuo (ver Tabela de Materiais) a 45 °C.</li>
	<li>Dessalgar as amostras secas seguindo os passos 5.8.1-5.8.8. Use água pura de grau de espectrometria de massa como solvente para os reagentes.<ol><li>Adicionar 100 μL de ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1% a cada amostra para dissolver completamente os peptídeos secos.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de acetonitrila a 100% (ACN) a cada coluna de dessalinização, centrifugar a 400 × g durante 3 min em RT e eliminar o efluente. Em seguida, adicionar 100 μL de ACN 50%, centrifugar a 400 × g por 3 min e descartar o efluente.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de TFA 0,1% a cada coluna de dessalinização, centrifugar a 400 × g por 3 min e descartar o efluente.</li>
		<li>Repita a etapa 5.8.3.</li>
		<li>Pipetar os péptidos dissolvidos na etapa 5.8.1 para a coluna de dessalinização, centrifugar a 400 × g durante 3 minutos e recuperar o efluente. Repita a etapa de carregamento da amostra para deixar a amostra de peptídeo adsorver na coluna de dessalinização.</li>
		<li>Repita a etapa 5.8.3 duas vezes.</li>
		<li>Adicionar 50 μL de 50% de ACN (contendo 0,1% de TFA) à coluna de dessalinização, centrifugar a 400 × g durante 3 minutos e recolher o efluente (péptidos) num novo tubo de centrifugação de grau de espectrometria de massa.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Secagem dos peptídeos dessalgados
<ol><li>Secar os peptídeos dessalgados em um concentrador centrífugo a vácuo (Configurações: modo V-AQ , temperatura: 45 °C e tempo: 50 min) e usá-los para análise subsequente de espectrometria de massa. NOTA: O processo de extração dos peptídeos dos sEVs deve ser realizado no gelo tanto quanto possível para evitar a degradação de proteínas. Todos os reagentes utilizados foram preparados com água grau espectrometria de massa para evitar contaminação plástica. Para a etapa 5.8, a dessalinização resulta na perda inevitável das amostras de peptídeos. Esta perda pode ser reduzida repetindo-se os passos 5.8.5 e 5.8.7.</li>
</ol>7. Análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS)
NOTA: Analisar a amostra dos peptídeos por cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS), especificamente o espectrômetro de massa Orbitrap Q Exactive HF-X conectado a um sistema LC de nano-alto desempenho EASY-nLC 1000 (consulte Tabela de Materiais).
<ol><li>Separe as amostras em uma coluna analítica C18 (1,9 μm de diâmetro de grão, 15 cm de comprimento x 150 μm de diâmetro interno) a uma taxa de fluxo de 60 nL/min com um gradiente de 65 min: 4%-15% por 4 min, 15%-28% por 28 min, 28%-40% por 10 min, 40%-69% por 10 min, 95% constante por 7 min, 95% diminuíram para 6% por 1 minuto e constante por 5 min (solvente A, água contendo 0,1% de ácido fórmico [FA]; solvente B, 80% de acetonitrila contendo 0,1% de AG, v/v).</li>
	<li>Ionizar os peptídeos eluídos em um pulverizador de ionização nano-electrospray (nano-ESI) a 320 °C temperatura capilar e tensão de pulverização de 2,2 kV.</li>
	<li>Colete os dados espectrais de massa usando o modo de aquisição dependente de dados com um poder de resolução de 120.000 para o modo de varredura completa e 15.000 no modo MS /MS .<ol><li>Execute varreduras completas no orbitrap da faixa de varredura de 250 m/z a 1800 m/z e janela de isolamento com 1,6 m/z.</li>
		<li>Selecione os 20 principais íons intensos para fragmentação de dissociação colisional de alta energia (HCD) com uma energia de colisão normalizada de 29% e meça no separador de íons. NOTA: As condições típicas de espectrometria de massa foram as seguintes: Os alvos de controle automático de ganho (AGC) foram 3 x 106 íons para varreduras completas e 2 x 105 para varreduras MS/MS; o tempo máximo de injeção foi de 80 ms para exames completos e 19 ms para exames MS/MS; e exclusão dinâmica por 13 s.</li>
	</ol></li>
</ol>

Isolando pequenas vesículas extracelulares e extraindo seu peptidome

<ol>
	<li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+PD-L1+contributes+to+immunosuppression+and+is+associated+with+anti-PD-1+response.">Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response.</a> Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).</li><li>Ti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-preconditioned+mesenchymal+stromal+cells+modify+macrophage+polarization+for+resolution+of+chronic+inflammation+via+exosome-shuttled+let-7b.">LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).</li><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+S100A4+derived+from+highly+metastatic+hepatocellular+carcinoma+cells+promotes+metastasis+by+activating+STAT3.">Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).</li><li>Xun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-derived+exosomal+miR-138-5p+modulates+polarization+of+tumor-associated+macrophages+through+inhibition+of+KDM6B.">Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B.</a> Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).</li><li>Tai, Y. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+urine+peptidomics+workflow+identifies+chemically+defined+dietary+gluten+peptides+from+patients+with+celiac+disease.">An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease.</a> Nature Communications. 13, 888 (2022).</li><li>Kalaora, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+bacteria-derived+HLA-bound+peptides+in+melanoma.">Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma.</a> Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).</li><li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+bioactive+peptides+for+biomaterials+design+and+therapeutics.">Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics.</a> Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+proteolysis+of+bioactive+peptides+using+a+peptidomics+approach.">Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach.</a> Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).</li><li>Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidome:+Chaos+or+inevitability.">Peptidome: Chaos or inevitability.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).</li><li>Keller, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+exosomes+provide+protection+against+bacterial+toxins.">Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins.</a> Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).</li><li>Koeppen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7b-5p+in+vesicles+secreted+by+human+airway+cells+reduces+biofilm+formation+and+increases+antibiotic+sensitivity+of+P.+aeruginosa.">Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).</li></ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Ao investigar a função de sEVs, é imperativo obter sEVs de alta pureza a partir de amostras biológicas complexas para evitar quaisquer contaminações potenciais. Uma variedade de métodos para o isolamento de sEVs tem sido desenvolvida13, e entre esses métodos, métodos baseados em ultracentrifugação diferencial têm mostrado pureza relativamente alta de sEVs. Neste estudo, 200 mL de sobrenadante celular foram coletados por 6 h, e cerca de 200-300 μg de sEVs foram obtidos por ultracentrif...

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) com diâmetro inferior a 200 nm estão presentes em quase todos os tipos de fluidos corporais e são secretadas por todos os tipos de células, incluindo urina, suor, lágrimas, líquido cefalorraquidiano e líquido amniótico1. Inicialmente, os sEVs foram considerados como recipientes para disposição de resíduos celulares, o que levou a pesquisas mínimas na década subsequente2. Recentemente, evidências crescentes indicam que os sEVs contêm proteínas específicas, lipídios, ácidos nucléicos e outros metabólitos. Essas moléculas são transportadas para as células-alvo3, contribuindo para a comunicação intercelular, por meio da qual participam de vários processos biológicos, como reparo tecidual, angiogênese, imunidade4 einflamação5,6, desenvolvimento tumoral e metástase7,8,9, etc.
Para facilitar o estudo de sEVs, é imperativo isolar sEVs de amostras complexas. Diferentes métodos de isolamento de sEVs foram desenvolvidos com base nas propriedades físicas e químicas de sEVs, tais como sua densidade, tamanho de partícula e proteínas marcadores de superfície. Essas técnicas incluem métodos baseados em ultracentrifugação, métodos baseados em tamanho de partículas, métodos baseados em captura de imunoafinidade, métodos baseados em precipitação de sEVs e métodos baseados em microfluídica10,11,12. Dentre essas técnicas, o método baseado em ultracentrifugação é amplamente reconhecido como o padrão-ouro para o isolamento de EVs e é a técnica mais comumente utilizada13.
Uma quantidade crescente de evidências sugere a presença de uma infinidade de peptídeos biologicamente ativos não descobertos nos peptidomas de vários organismos. Esses peptídeos contribuem significativamente para inúmeros processos fisiológicos, regulando o crescimento, o desenvolvimento, a resposta ao estresse 14,15 e a transdução de sinal16. O objetivo do peptidoma dos sEVs é descobrir os peptídeos transportados por esses sEVs e fornecer pistas sobre suas funções biológicas. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento de sEVs através de ultracentrifugação diferencial, seguido de extração de peptídeos desses sEVs para análise posterior de seu peptidoma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Beyotime Technology</td>
			<td>P0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td>Beyotime Technology</td>
			<td>AF1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357003</td>
			<td>High-speed centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8220</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium</td>
			<td>Cell World</td>
			<td>N?A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRP94</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>20292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti JXN-26</td>
			<td>Centrifuge rotor (JA-25.50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)</td>
			<td>National Institute of Biological Sciences, China</td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>l1149</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357448</td>
			<td>1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano-high-performance LC system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EASY-nLC 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle tracking analysis&#160;</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight NTA3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyallomer centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td>Ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Bimake</td>
			<td>B14002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Concentrator plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima MAX-XP</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor (TLA 55)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>H-7650B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AF8258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cell disruptor</td>
			<td>Scientz</td>
			<td>SCIENTZ-IID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDocXRs</td>
			<td>Image lab 4.0 (beta 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3853</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of peptides of small extracellular vesicles from bone marrow-derived macrophages

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) são tipicamente secretadas pela exocitose de corpos multivesiculares (MVBs). Estas nanovesículas com um diâmetro de <200 nm estão presentes em vários fluidos corporais. Esses sEVs regulam vários processos biológicos, como transcrição e tradução de genes, proliferação e sobrevivência celular, imunidade e inflamação por meio de suas cargas, como proteínas, DNA, RNA e metabólitos. Atualmente, várias técnicas têm sido desenvolvidas para o isolamento de sEVs. Dentre eles, o método baseado em ultracentrifugação é considerado o padrão-ouro e é amplamente utilizado para o isolamento de sEVs. Os peptídeos são naturalmente biomacromoléculas com menos de 50 aminoácidos de comprimento. Esses peptídeos participam de uma variedade de processos biológicos com atividade biológica, como hormônios, neurotransmissores e fatores de crescimento celular. O peptidoma destina-se a analisar sistematicamente peptídeos endógenos em amostras biológicas específicas por cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS). Aqui, introduzimos um protocolo para isolar sEVs por ultracentrifugação diferencial e extraímos peptidoma para identificação por LC-MS/MS. Este método identificou centenas de peptídeos derivados de sEVs de macrófagos derivados da medula óssea.

Small extracellular vesicles (sEVs) with a diameter of less than 200 nm are present in almost all types of body fluids and secreted by all kinds of cells, including urine, sweat, tears, cerebrospinal fluid, and amniotic fluid1. Initially, sEVs were considered as receptacles for disposing of cellular waste, which led to minimal research in the subsequent decade2. Recently, increasing evidence indicates that sEVs contain specific proteins, lipids, nucleic acids, and other metabolites. These molecules are transported to target cells3, contributing to intercellular communication, through which they participate in various biological processes, such as tissue repair, angiogenesis, immunity4 and inflammation5,6, tumor development and metastasis7,8,9, etc.
To facilitate the study of sEVs, it is imperative to isolate sEVs from complex samples. Different sEVs isolation methods have been developed based on the physical and chemical properties of sEVs, such as their density, particle size, and surface marker proteins. These techniques include ultracentrifugation-based methods, particle size-based methods, immunoaffinity capture-based methods, sEVs precipitation-based methods, and microfluidics-based methods10,11,12. Among these techniques, the ultracentrifugation-based method is widely recognized as the gold standard for sEVs isolation and is the most commonly used technique13.
An increasing amount of evidence suggests the presence of a multitude of undiscovered biologically active peptides in the peptidomes of various organisms. These peptides significantly contribute to numerous physiological processes by regulating growth, development, stress response14,15, and signal transduction16. The objective of sEVs&#39; peptidome is to uncover the peptides carried by these sEVs and provide clues to their biological functions. Here, we present a protocol of isolating sEVs through differential ultracentrifugation, followed by extraction of peptides from these sEVs for further analysis of their peptidome.

Autor em destaque: Extração de peptidoma de pequenas vesículas extracelulares isoladas de macrófagos derivados da medula óssea 

Identificação de Peptídeos de Pequenas Vesículas Extracelulares de Macrófagos Derivados da Medula Óssea

We explore the functional roles of extracellular vesicles in innate immunity. We have developed a protocol to isolate small extracellular vesicles, or sEVs, via differential ultracentrifugation and identify the peptidome by LC-MS/MS, revealing the key biological functions of the peptides in sEVs. The extracellular vesicles have been shown to mediate intercellular communication by transporting cargo to recipient cells, such as proteins, lipids, and nucleic acids.By releasing antimicrobial components, they act the first line of defense against invading microbes in innate immunity. While differential ultracentrifugation yields highly pure small extracellular sEVs, it can be time-consuming and often results in low yields. In our study, these are major challenges for the stable identification of low-abundance peptides in the sEVs.

Para os sEVs isolados por ultracentrifugação diferencial (Figura 1), avaliamos sua morfologia, distribuição granulométrica e marcadores proteicos de acordo com a Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV)17.
Primeiramente, a morfologia das EVs foi observada por MET, mostrando uma estrutura típica em forma de taça (Figura 2A). NTA mostrou que os sEVs isolados estavam concentrados principa...

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Este protocolo descreve um procedimento para isolar pequenas vesículas extracelulares de macrófagos por ultracentrifugação diferencial e extrair o peptidoma para identificação por espectrometria de massas.

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...

Exploramos o papel funcional das vesículas extracelulares na imunidade inata. Desenvolvemos um protocolo para isolar pequenas vesículas extracelulares, ou sEVs, via ultracentrifugação diferencial e identificar o peptidoma por LC-MS/MS, revelando as principais funções biológicas dos peptídeos em sEVs. Foi demonstrado que as vesículas extracelulares mediam a comunicação intercelular transportando carga para as células receptoras, como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos.Ao liberar componentes antimicrobianos, eles atuam como a primeira linha de defesa contra micróbios invasores na imunidade inata. Embora a ultracentrifugação diferencial produza pequenos sEVs extracelulares altamente puros, ela pode ser demorada e muitas vezes resulta em baixos rendimentos. Em nosso estudo, estes são os principais desafios para a identificação estável de peptídeos de baixa abundância nos sEVs.

identification-peptides-small-extracellular-vesicles-from-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

1.2K visualizações.  Anhui Medical University. Exploramos o papel funcional das vesículas extracelulares na imunidade inata. Desenvolvemos um protocolo para isolar pequenas vesículas extracelulares, ou sEVs, via ultracentrifugação diferencial e identificar o peptidoma por LC-MS/MS, revelando as principais funções biológicas dos peptídeos em sEVs. Foi demonstrado que as vesículas extracelulares mediam a comunicação intercelular transportando carga para as células receptoras, como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos.

Vídeo: Autor em destaque: Extração de peptidoma de pequenas vesículas extracelulares isoladas de macrófagos derivados da medula óssea 

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of &lt;200 nm are present in various body fluids. These sEVs regulate various biological processes such as gene transcription and translation, cell proliferation and survival, immunity and inflammation through their cargos, such as proteins, DNA, RNA, and metabolites. Currently, various techniques have been developed for sEVs isolation. Among them, the ultracentrifugation-based method is considered the gold standard and is widely used for sEVs isolation. The peptides are naturally biomacromolecules with less than 50 amino acids in length. These peptides participate in a variety of biological processes with biological activity, such as hormones, neurotransmitters, and cell growth factors. The peptidome is intended to systematically analyze endogenous peptides in specific biological samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Here, we introduced a protocol to isolate sEVs by differential ultracentrifugation and extracted peptidome for identification by LC-MS/MS. This method identified hundreds of sEVs-derived peptides from bone marrow-derived macrophages.

This protocol describes a procedure to isolate small extracellular vesicles from macrophages by differential ultracentrifugation and extract the peptidome for identification by mass spectrometry.

Bioquímica

Isolating Small Extracellular Vesicles (sEVs) by Differential Ultracentrifugation

Isolating Small Extracellular Vesicles (SEVs) by Differential Ultracentrifugation  

To begin, centrifuge FBS overnight in an ultracentrifuge at 110, 000 G and four degrees Celsius to remove the endogenous sEVs. Sterilize the supernatant by filtering it through a 0.2 micron ultrafiltration membrane to yield sEVs-free FBS. Next in a 150 millimeter culture dish, plate about 3 times 10 to the seventh immortalized bone-marrow-derived macrophages in 20 milliliters of DMEM culture medium.Incubate the dish at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide overnight prior to collecting the sEVs from the macrophages. The next day, after discarding the medium, wash the cells with phosphate-buffered saline or PBS. Replace the medium with DMEM containing 10%sEVs-free free fetal bovine serum before incubating the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.Based on the experiment's requirements, collect and transfer the cells'supernatant to 50 milliliter centrifuge tubes. Centrifuge the tubes at 300 G for 10 minutes to remove the cells. Transfer the result in supernatant from each tube to a new 50 milliliter centrifuge tube and discard the pellet.This time, centrifuge the supernatant at 2000 G for 10 minutes to remove dead cells. Then transfer the supernatant to new high-speed centrifuge tubes and discard the pellets. Next to remove debris and microvesicles, centrifuge the obtained supernatant at 10, 000 G for 30 minutes using a high-speed centrifuge.Transfer the resulting supernatant to new ultracentrifuge tubes by adding 35 milliliters in each tube and discarding the pellets. Centrifuge the ultracentrifuge tubes in a swinging bucket rotor centrifuge at 110, 000 G for 70 minutes before discarding the supernatant. Wash the resulting crude sEVs-enriched pellet with one milliliter of PBS.Again, add one milliliter of PBS to the washed pellet in one of the tubes, and mix by pipetting continuously. Transfer the one milliliter of resultant PBS suspension to another tube containing the pellet, and repeat the same until all pellets in the tubes are mixed by pipetting. Transfer the resultant one milliliter of sEVs-rich PBS to a new ultracentrifuge tube.Then centrifuge the new tube in a tabletop ultracentrifuge at 110, 000 G for 70 minutes. After discarding the supernatant, wash the resulting crude sEVs-enriched pellet with 100 microliters of PBS. Add 1.2 milliliters of protein preparation solution in a standard protein tube to dissolve the 30 milligrams of BSA present in it.Dilute the resulting protein standard solution with PBS to reduce its concentration from 25 to 0.5 milligrams per milliliter. Add eight different volumes of the diluted protein standard solution into wells of a 96-well plate, and bring the volume to 20 microliters in each well using PBB. Add 18 microliters of HEPES lysis buffer to the sample wells, followed by the addition of two microliters of the sEVs samples.Next, add 200 microliters of BCA working solution prepared per the manufacturer's instructions into each well. Allow the plate to rest at room temperature for 20 to 30 minutes. Finally, measure the absorbance at 562 nanometers using a microplate reader.Calculate the total protein content in the sEVs using the obtained results. The transmission electron microscopy images of the isolated sEVs displayed a typical cup-like morphology. Nanoparticle tracking analysis showed that the isolated sEVs were mostly concentrated at 136 nanometers.Western blot showed that isolated sEVs were significantly enriched of sEVs markers, including CD9, beta-actin, and TSG101. The endoplasmic reticulate marker GRP94 was only detected in the whole-cell lysate. The results indicated that the method employed yielded sEVs with a high level of purity.

Isolamento de pequenas vesículas extracelulares (sEVs) por ultracentrifugação diferencial

Extraction of Peptides from Isolated Small Extracellular Vesicles (sEVs)

To begin, wash the isolated small extracellular vesicles or SEVs twice by ultracentrifugation at 110, 000 G and four degrees Celsius for 70 minutes. Re-suspend the vesicles in 500 microliters of phosphate buffered saline or PBS. Then, add five microliters of 100X protease inhibitor to it.Subject the sample to ultrasonic crushing at 40 watts for 10 minutes, with three second ultrasonic time, and five second interval time. Centrifuge the crushed mixture at 13, 700 G for 15 minutes at four degrees Celsius. To the obtained supernatant, add dithiothreitol to a final concentration of 50 millimolar.And incubate it in a water bath at 56 degrees Celsius for 30 minutes. Then add 50 microliters of one molar iodoacetamide to the supernatant. And allow it to react at room temperature for 20 minutes in the dark.Centrifuge the mixture at 13, 700 G and four degrees Celsius for 15 minutes. And transfer the supernatant containing the crude peptide extract to a 10 kilodalton ultracentrifuge tube. Remove protein from the crude peptide by centrifuging the ultra filtration tube at 13, 700 G and four degrees Celsius for one hour.Dry the collected effluent in a vacuum centrifugal concentrator at 45 degrees Celsius. For desalting, use mass spectrometry grade pure water as a solvent for all reagents. First, dissolve the dry peptides in 100 microliters of 0.1%trifluoracetic acid or TFA, and keep it aside.Then add 100 microliters of pure acetonitrile to each desalting column. Centrifuge the columns at 400 G for three minutes at room temperature, and discard the effluent. Then add 100 microliters of 50%acetonitrile per desalting column, and repeat the centrifugation as mentioned previously before discarding the effluent.Next, add 100 microliters of 0.1%TFA to each desalting column before centrifuging as mentioned previously. Once again, discard the effluent. Now, pipet the desalt peptides into the desalting column.Centrifuge the columns as mentioned previously to load the sample. Add the recovered effluent back to the desalting column to repeat the loading. Then, add 100 microliters of 0.1%TFA.Centrifuge as mentioned previously, and discard the effluent. Finally, add 50 microliters of 50%acetonitrile containing 0.1%TFA to the peptide in the desalting column. After centrifusion, as mentioned previously, collect the effluent in a new mass spectrometry grade centrifuge tube.