MDA-MB-231 foram um presente gentil do Dr. Shane Stecklein. Os autores agradecem o financiamento do Centro de Câncer da Universidade do Kansas para realizar esta pesquisa.

NOTA: Todo o trabalho de cultura de células é feito em um gabinete de biossegurança com jaleco, luvas e seguindo técnicas assépticas padrão.
1. Gerando CAR expressando Jurkats (CAR-J)
<ol><li>Compre células Jurkat, clone E6-1 da ATCC. Descongelar 1 x 106 células em frasco T-75 e cultivá-las em frascos T-75. Mantê-los em suspensão a 0,6 x 106 células por mL usando o meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com FBS a 10% em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Placa 1 x 105 células Jurkat por poço de uma cultura de tecidos tratada placa de 24 poços em 500 μL de meio de crescimento RPMI contendo 4 μg/mL de polibreno que aumenta a eficiência lentiviral. Conte células usando um analisador de células de bancada de detecção fluorescente baseado em laser. O número de poços depende do número de construtos a serem avaliados. Este exemplo usará 4 construções e um controle não transduzido. O desenho do construto CAR é mostrado na Tabela 1.</li>
	<li>Adicionar 10 μL de lentivírus/poço de cada construção CAR. O projeto de construção do CAR e a produção de lentivírus foram feitos conforme descrito anteriormente12.</li>
	<li>No dia seguinte, adicionar 1 mL de meio RPMI de crescimento a cada poço e continuar a cultura na incubadora a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Coletar células 2 dias depois (total de 72 h após a transdução de Jurkat) e contá-las.</li>
	<li>Tome 1 x 104 células para fluxo de corrida para confirmar a expressão CAR nas células Jurkat. Resumidamente, lave as células 2x com solução de coloração FACS (FSS) antes de rotular o CAR-J com anticorpos direcionados à etiqueta Flag usada para detectar positividade de CAR por 30 minutos no escuro a 4 °C. Lavar novamente 2x com FSS e passar as células através de um citômetro de fluxo como descrito anteriormente12. Use a concentração de anticorpos conforme recomendado pelo fabricante.</li>
	<li>As células Jurkat são facilmente transduzidas e quase sempre apresentam expressão >90% do CAR. Produzir CAR-J muito antes do ensaio de citotoxicidade da co-cultura e congelar para uso posterior.</li>
</ol>2. Plating CFSE células tumorais marcadas
NOTA: AS CÉLULAS MDA-MB-231 (da ATCC, HTB-26) foram um presente de um colaborador, e EGFR KO MDA-MB-231 foram criadas conforme descrito anteriormente12.
<ol><li>Descongelar 1 x 106 células em frasco T-75 e cultivá-las em frascos T-75. Manter células tumorais MDA-MB-231 e células tumorais CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 em 14 mL de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em incubadora a 37 °C com 5% de CO2 e dividido quando aproximadamente 70% confluente.</li>
	<li>Observe células tumorais aderentes sob microscópio de campo claro regular para garantir quase 70% de confluência.</li>
	<li>Retirar o meio de crescimento do frasco com uma pipeta serológica. Adicionar 3 ml de tripsina ao balão T75 e colocar numa estufa a 37 °C com CO2 a 5% durante 3-5 minutos para separar as células do balão.</li>
	<li>Neutralizar a tripsina utilizando igual quantidade (3 mL) de meio de crescimento. Recolher a suspensão celular num tubo de centrifugação e girar as células a 400 x g durante 4 minutos para peletizar as células.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante com pipeta e ressuspenda as células em 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Determine a concentração celular usando um contador de células.</li>
	<li>Transfira 8 x 105 células para outro tubo de 15 mL e adicione PBS para chegar a um volume de 1 mL.</li>
	<li>Adicionar 2 μL de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE; concentração de estoque de 5 μM) em cada tubo e misturar bem usando uma pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Incubar as células com CFSE durante 20 min na estufa a 37 °C com 5% de CO2. Retire os tubos da incubadora após 20 min e adicione 5 mL de meio de crescimento ao tubo.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 400 x g por 4 min para pelar as células marcadas com CFSE. Eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta e adicionar 1 ml de meio fresco para ressuspender as células.</li>
	<li>Reavalie a concentração celular usando um contador de células. Transfira 4 x 105 células para um reservatório de reagente de 25 mL e adicione meios para um volume total de 8 mL.<ol><li>Para garantir volume suficiente para semear 5000 células tumorais/poço em 100 μL de meio, o volume necessário para ser capaz de pipetar usando a pipeta multicanal, e para compensar a perda de algumas células durante a etapa 1.7, preparar 10%-20% de células extras e volume de meio.</li>
	</ol></li>
	<li>Misturar bem a suspensão celular com uma pipeta serológica de 5 ml. Usando uma pipeta multicanal de 100 μL, pipete 100 μL da suspensão celular em cada fileira da placa preta preta de fundo plano transparente de 96 poços na metade esquerda. Uma estratégia de plaqueamento amostral pode ser encontrada na Tabela 2.</li>
	<li>Pipetar células EGFR KO de forma semelhante na metade direita da placa. Uma vez que toda a placa é plaqueada, arraste a placa para frente e para trás e de um lado para o outro na plataforma da capela de cultura de tecidos para garantir uma distribuição uniforme das células tumorais nos poços.</li>
	<li>Incubar a placa durante 4 h na incubadora a 37 °C com 5% de CO2 para que as células tumorais se fixem.</li>
</ol>3. Co-cultivo de CAR expressando Jurkats com células tumorais marcadas com CFSE
<ol><li>Usando as contagens de células Jurkat não transduzidas e CAR expressando, transfira 4 x 105 células de cada CAR-J para um reservatório de 25 mL. Adicionar meio de crescimento DMEM para um volume total de 2 mL.</li>
	<li>Para E:T de 4:1, 2 x 104 CAR-J foram adicionados por poço em 100 μL de meio usando uma pipeta multicanal suavemente ao longo da lateral de cada poço para não perturbar as células tumorais aderidas.</li>
	<li>Adicione mais 100 μL de meio de crescimento usando uma pipeta multicanal ao lado de poços contendo células tumorais e células Jurkat. Os grupos tumorais recebem apenas 200 μL de meio para totalizar 300 μL de meio em todos os poços.</li>
	<li>Arraste a placa ao longo da plataforma em movimento para frente e para trás e de um lado para o outro para garantir uma distribuição uniforme das células de Jurkat nas células tumorais.</li>
	<li>Permitir a cocultura na incubadora a 37 °C com 5% de CO2 durante 48 h.</li>
</ol>4. Preparo da placa para aquisição de imagens
<ol><li>Fazer uma solução de iodeto de propídio (PI) a 1 μg/mL em meios de fluorescência de fundo baixo com base no número de poços e cada um obtendo 100 μL de meio.</li>
	<li>Para 84 poços preparar 9 mL de meio contendo IP. Misture bem a mídia usando uma pipeta.</li>
	<li>Completar 10 ml de solução de Triton-X a 20% diluindo Triton-X com água deionizada. Após 48 h de cultivo de co, descarte o sobrenadante contendo CAR-J por uma única inversão da placa e toque em papel toalha.</li>
	<li>Agora adicione 100 μL do meio preparado acima (passo 4.2) contendo IP em cada poço usando uma pipeta multicanal suavemente para não perturbar as células tumorais aderidas.</li>
	<li>Adicionar 20 μL de solução de Triton-X a 20% ao primeiro poço de cada tipo de tumor que funcione como um controle morto total.</li>
	<li>Deixe a placa na incubadora por 20 min. Imagem da placa usando o citômetro de imagem fluorescente. Os dados são armazenados no computador e podem ser analisados posteriormente.</li>
</ol>5. Análise de imagens fluorescentes
<ol><li>Use um dos tumores apenas bem de células para definir o canal verde fluorescente.</li>
	<li>Diminua a máscara do poço para 98% para remover as células na borda do poço, pois o sinal não é perfeito na borda.</li>
	<li>Identificar células tumorais marcadas com CFSE no canal CFSE verde e fluorescente. Modifique o valor limite de intensidade de fluorescência para captar todas as células do poço.</li>
	<li>Defina o diâmetro mínimo da célula para 25 μm para remover quaisquer detritos detectados no canal CFSE. Isso varia de acordo com o tipo de célula analisada.</li>
	<li>Habilite Objetos de toque separados para identificar células individuais quando estiverem em contato umas com as outras.</li>
	<li>Selecione CFSE na exibição da imagem e observe a sobreposição gráfica para descobrir o que está sendo escolhido pelo sistema.</li>
	<li>Uma vez que as células marcadas com CFSE estão sendo adequadamente captadas, estabeleça portas para definir a população de células vivas versus mortas.</li>
	<li>Selecionando as células marcadas com CFSE, gere um histograma de contagens no eixo y versus intensidade média do IP no eixo x.</li>
	<li>Com base no poço onde adicionamos Triton-X (passo 4.5), desenhe um divisor para diferenciar células coradas com baixo IP versus células coradas com alto PI. Este poço deve ter a maioria das células em uma região corada por PI alto. NOTA: O PI mostra o sinal basal em células vivas. Assim, a adição de Triton-X mata todas as células e elas ficam brilhantes no canal fluorescente vermelho. Isso facilita o desenho de portas para separar células mortas de células vivas.</li>
	<li>Ajuste o valor do eixo x para poder visualizar melhor as células. Agora rotule as células coradas com baixo IP como células vivas.</li>
	<li>Selecionando as células vivas, defina outro histograma com área no eixo x e conte no eixo y.</li>
	<li>Desenhe outro divisor usando o tumor apenas bem para capturar células e não detritos. Os poços tratados com Jurkat começarão a acumular detritos que serão manchados e precisarão ser removidos das contagens. Os restantes não detritos são rotulados como "células grandes".</li>
	<li>Execute a análise em toda a chapa e exporte a planilha contendo os números.</li>
	<li>Plotar as contagens de Big para identificar o número de células tumorais vivas marcadas com CFSE remanescentes no poço após a exposição ao CAR-J. Determine estatísticas usando ANOVA unidirecional.</li>
</ol>

Avaliando a morte quantitativa de células tumorais por células Jurkat que expressam CAR

<ol>
	<li>Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+bench+to+bedside:+the+history+and+progress+of+CAR+T+cell+therapy.">From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy.</a> Front Immunol. 14, 1188049 (2023).</li><li>Labanieh, L., Mackall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+immune+cells:+design+principles,+resistance+and+the+next+generation.">CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation.</a> Nature. 614, 635-648 (2023).</li><li>Sterner, R. C., Sterner, R. 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J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening+assay+to+identify+agents+that+enhance+T-cell+recognition+of+human+melanomas.">A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas.</a> Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).</li><li>Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+media+for+fluorescence+imaging:+Striking+the+right+balance+between+signal+strength+and+long-term+cell+health.">Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health.</a> Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).</li><li>. Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing">https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing</a> (2023)</li><li>Kessel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+3D+tumor+spheroid+screening+method+for+cancer+drug+discovery+using+celigo+image+cytometry.">High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry.</a> SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui nós propusemos um método rápido para avaliar eficientemente a atividade citolítica alvo-específica induzida pela expressão de CAR em células Jurkat. Todas as construções CAR têm o mesmo scFv, mas diferentes domínios de dobradiça e transmembrana que demonstraram afetar a potência das células CAR-T13. Uma avaliação mais aprofundada da morte inespecífica por esses CAR-J foi feita cultivando-os com células de nocaute de antígeno (KO). Isso demonstra que a morte é antígeno tum...

A terapia celular CAR-T tem se mostrado uma grande promessa em neoplasias hematológicas, evidente a partir dos 6 produtos CAR-T aprovados pela FDA desde 2017, conforme relatado pelo Instituto Nacional do Câncer1. Existem numerosas células CAR-T em ensaios clínicos para atingir tumores sólidos. A engenharia de novos alvos CAR e a otimização da construção do CAR são vitais para a eficácia de uma célula CAR-T. A escolha da construção CAR ideal para cada aplicação é essencial para o direcionamento preciso de antígenos associados ao tumor (TAA), evitando baixos níveis de expressão de TAA em tecidos normais2.
Uma construção CAR é feita principalmente de cinco compartimentos: (1) domínio de fragmento variável de cadeia única extracelular (scFv) visando antígeno tumoral; (2) domínio da dobradiça; (3) domínio transmembrana; (4) domínio costimulatório de células T citoplasmáticas intracelulares; e (5) domínio da sinalização. A modificação de cada um desses domínios afeta a precisão do envolvimento da célula CAR-T com sua célula-alvo3. Assim, avaliar a citotoxicidade e a reatividade cruzada desses construtos CAR in vitro é fundamental para escolher o construto certo para progredir em direção a experimentos in vivo. Os métodos atuais de avaliação da citólise por células T incluem ensaio de liberação de 51Cr, ensaio de liberação de lactato desidrogenase, ensaio de imagem bioluminescente, análise celular baseada em impedância em tempo real e ensaio de citometria de fluxo baseado em células 4,5. A plataforma baseada em imagem fluorescente descrita aqui identifica o número de células vivas versus mortas, que é uma quantificação direta da citólise de células T em oposição a um método indireto de avaliação da citólise por células T.
Aqui está uma técnica fácil, econômica, rápida e de alto rendimento com intervenção mínima para avaliar a citotoxicidade de células Jurkat expressando o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) CAR contra células de câncer de mama triplo-negativo (TNBC) MDA-MB-231 e células EGFR CRISPR nocautear células MDA-MB-231. As células Jurkat são células de linfócitos T humanos imortalizadas6 que têm sido amplamente utilizadas para estudar os mecanismos de ativação e sinalização das células T7. Além disso, células Jurkat têm sido utilizadas para testes in vitro de CAR em múltiplos estudos 8,9,10,11. As células de Jurkat são facilmente transduzidas por lentivírus e têm proliferação sustentada, e este sistema foi aproveitado para otimizar o domínio da dobradiça de várias construções EGFR CAR.
Este ensaio pode ser usado para rastrear múltiplas construções CAR visando vários antígenos tumorais e usado contra múltiplas linhagens de células tumorais aderentes e em várias relações efetor para tumor (E:T). Além disso, vários pontos de tempo podem ser avaliados, e o número de réplicas pode ser modificado para identificar a melhor matança entre as várias construções do CAR. Os melhores construtos precisam ser confirmados usando células T CD3 derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). O objetivo geral por trás do desenvolvimento deste método é otimizar rapidamente a geometria da dobradiça CAR de uma maneira de alto rendimento, superando barreiras como baixa eficiência de transdução, seguida de confirmação em células T derivadas do PBMC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube (Sterile)</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>#C15B</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube (Sterile)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black/Clear 96 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353219</td>
			<td>Celligo has a list of compatible plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter</td>
			<td>Nexcelcom Bioscience</td>
			<td>200-BFFL-5C</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Software</td>
			<td>Nexcelcom Bioscience</td>
			<td>Version 5.3.0.0</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HeraCell 160i</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>13-0850-U500</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Cytek</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-040</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Cytek, BD, etc</td>
			<td>Aurora, LSR II, etc</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Sortware</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Company&#160;</td>
			<td>Version 10.7.1</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorobrite DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 9.3.1 (471)</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichanel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Finnpipette F2</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-031</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)</td>
			<td>Pr1ma</td>
			<td>PR-1250RK-FL, etc</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Finnpipette F2</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-041-cv</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette Aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-105</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes (Sterile, various sizes)</td>
			<td>Pr1ma</td>
			<td>PR-SERO-25, etc</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Reservoirs</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>RESE-2000</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vitro cytotoxicity evaluation of jurkat expressing chimeric antigen receptor using fluorescent imaging

As células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) estão na vanguarda da oncologia. Um CAR é construído de um domínio de alvo (geralmente um fragmento variável de cadeia única, scFv), com um elo intra-cadeia que o acompanha, seguido por uma dobradiça, transmembrana e domínio costimulatório. A modificação do domínio do elo intra-cadeia e da dobradiça pode ter um efeito significativo na matança mediada pelo CAR. Considerando as muitas opções diferentes para cada parte de uma construção CAR, há um grande número de permutações. Fazer células CAR-T é um processo demorado e caro, e fazer e testar muitas construções é um investimento pesado de tempo e material. Este protocolo descreve uma plataforma para avaliar rapidamente construções CAR otimizadas para dobradiças em células Jurkat (CAR-J). As células Jurkat são uma linhagem de células T imortalizadas com alta captação de lentivírus, permitindo uma transdução eficiente de CAR. Aqui, apresentamos uma plataforma para avaliar rapidamente o CAR-J usando um imageador fluorescente, seguido pela confirmação de citólise em células T derivadas do PBMC.

CAR-T cell therapy has shown great promise in hematological malignancies, evident from the 6 FDA-approved CAR-T products since 2017, as reported by the National Cancer Institute1. There are numerous CAR-T cells in clinical trials for targeting solid tumors. Engineering novel CAR targets and optimizing the CAR construct is vital to the efficacy of a CAR-T cell. Choosing the ideal CAR construct for each application is essential for accurate targeting of tumor associated antigens (TAA) while avoiding low levels of TAA expression in normal tissues2.
A CAR construct is primarily made of five compartments: (1) extracellular single-chain variable fragment (scFv) domain targeting tumor antigen; (2) hinge domain; (3) transmembrane domain; (4) intracellular cytoplasmic T cell costimulatory domain; and (5) signaling domain. Modifying each of these domains affects the precision of the CAR-T cell engaging with its target cell3. Hence, evaluating the cytotoxicity and cross-reactivity of these CAR constructs in vitro is critical to choose the right construct for progressing toward in vivo experiments. Current methods of evaluating cytolysis by T cells include 51Cr release assay, lactate dehydrogenase release assay, bioluminescent imaging assay, real-time impedance-based cell analysis, and cell-based flow cytometry assay4,5. The fluorescent imaging-based platform described here identifies the number of live vs. dead cells, which is a direct quantification of T cell cytolysis as opposed to an indirect method of evaluating the cytolysis by T cells.
Here is an easy, cost-efficient, rapid, and high throughput technique with minimal intervention to evaluate the cytotoxicity of Jurkat cells expressing epidermal growth factor receptor (EGFR) CAR against MDA-MB-231 triple-negative breast cancer (TNBC) cells and EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231 cells. Jurkat cells are immortalized human T Lymphocyte Cells6 that have been widely used for studying T cell activation and signaling mechanisms7. Furthermore, Jurkat cells have been used for in vitro CAR testing in multiple studies8,9,10,11. Jurkat cells are easily transduced by lentivirus and have sustained proliferation, and this system was leveraged to optimize the hinge domain of various EGFR CAR constructs.
This assay can be used for screening multiple CAR constructs targeting various tumor antigens and used against multiple adherent tumor cell lines and in various effector to tumor (E:T) ratios. Additionally, multiple time points can be evaluated, and number of replicates can be modified to identify best killing among the various CAR constructs. The best constructs need to be confirmed using peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) derived CD3 T cells. The overall goal behind developing this method is to rapidly optimize CAR hinge geometry in a high throughput manner overcoming barriers such as low transduction efficiency, followed by confirmation in PBMC derived T cells.

Autor em destaque: Triagem de alto rendimento de construções de células T CAR para citotoxicidade aprimorada e memória imunológica 

Avaliação Rápida da Citotoxicidade In Vitro do Receptor de Antígeno Quimérico Jurkat Expressando Usando Imagem Fluorescente

CAR T-cells are being constantly improved to achieve better responses in human clinical trials. We are identifying ways to evaluate this in our lab using an unbiased high throughput method, such as using fluorescent imaging to screen combinations that work best. There are several combinations of constructs that can be designed for any single chain variable fragment by modifying the geometry of the extracellular and hinge domains.We have designed this protocol to identify the combinations with the best efficacy in eliminating target cells using Jurkat cells. This is a rapid, high throughput protocol to screen CAR constructs based on its target cell cytotoxicity using Jurkat cells, which are then validated with conventional T-cells. A dozen different CAR constructs can be tested in a 96-well plate simultaneously using this technique.Here in Akhavan Lab, we quantify in absolute numbers the direct cyclosis of target cells by the CAR expressing Jurkat cells in a high throughput manner to screen multiple CAR constructs. Our laboratory's primary aim is to improve the clinical translation of CAR T-cell therapy against high grade brain tumors. We leverage high throughput drug screens as one modality to improve CAR T-cell cytotoxicity, as well as targeting the tumor microenvironment.

Uma faixa de relação E:T entre 1:8 e 8:1 para CAR-J1 foi avaliada em 72 h que teve como alvo EGFR em células TNBC MDA-MB-231. As células Jurkat foram transduzidas com lentivírus CAR com polibreno para gerar células CAR-J conforme descrito na etapa 2. A citotoxicidade do CAR-J1 aumentou significativamente com maior relação E:T, sem diferença na morte na proporção de 1:8 (Figura 1). Mais de 50% de mortes foram observadas às 4:1 E:T ao longo de 72 h. Este E:T foi usado para experime...

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Um protocolo para avaliar a morte quantitativa de células tumorais por células Jurkat expressando receptor de antígeno quimérico (CAR) visando antígeno único tumoral. Este protocolo pode ser usado como uma plataforma de triagem para otimização rápida de construções de dobradiças CAR antes da confirmação em células T derivadas do sangue periférico.

Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are at the forefront of oncology. A CAR is constructed of a targeting domain (usually a single chain variable ...

As células T CAR estão sendo constantemente aprimoradas para alcançar melhores respostas em testes clínicos em humanos. Estamos identificando maneiras de avaliar isso em nosso laboratório usando um método imparcial de alto rendimento, como o uso de imagens fluorescentes para selecionar combinações que funcionam melhor. Existem várias combinações de construtos que podem ser projetados para qualquer fragmento variável de cadeia única, modificando a geometria dos domínios extracelular e de dobradiça.Desenhamos este protocolo para identificar as combinações com melhor eficácia na eliminação de células-alvo usando células Jurkat. Este é um protocolo rápido e de alto rendimento para rastrear construções de CAR com base em sua citotoxicidade de células-alvo usando células Jurkat, que são então validadas com células T convencionais. Uma dúzia de construções diferentes do CAR podem ser testadas em uma placa de 96 poços simultaneamente usando essa técnica.Aqui no Laboratório de Akhavan, quantificamos em números absolutos a ciclose direta de células-alvo pelo CAR expressando células Jurkat de uma maneira de alto rendimento para selecionar várias construções CAR. O objetivo primário do nosso laboratório é melhorar a tradução clínica da terapia com células T CAR contra tumores cerebrais de alto grau. Aproveitamos as telas de drogas de alto rendimento como uma modalidade para melhorar a citotoxicidade das células T CAR, bem como visando o microambiente tumoral.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Rapid In Vitro Cytotoxicity Evaluation of Jurkat Expressing Chimeric Antigen Receptor using Fluorescent Imaging

1.6K visualizações.  University of Kansas Cancer Center. As células T CAR estão sendo constantemente aprimoradas para alcançar melhores respostas em testes clínicos em humanos. Estamos identificando maneiras de avaliar isso em nosso laboratório usando um método imparcial de alto rendimento, como o uso de imagens fluorescentes para selecionar combinações que funcionam melhor. Existem várias combinações de construtos que podem ser projetados para qualquer fragmento variável de cadeia única, modificando a geometria dos domínios extracelu...