MDA-MB-231, Dr. Shane Stecklein'ın nazik bir hediyesiydi. Yazarlar, bu araştırmayı yürütmek için Kansas Üniversitesi Kanser Merkezi'nden fon aldığını kabul ediyor.

NOT: Tüm hücre kültürü çalışmaları, laboratuvar önlüğü, eldivenler ve standart aseptik teknikler izlenerek bir biyogüvenlik kabininde yapılır.
1. Jurkatları ifade eden CAR oluşturma (CAR-J)
<ol><li>Jurkat hücrelerini satın alın, ATCC'den E6-1'i klonlayın. Bir T-75 şişesinde 1 x 106 hücreyi çözün ve bunları T-75 şişelerinde kültürleyin. % 5 CO 2 ile 37 ° C'de bir inkübatörde% 10 FBS ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamını kullanarak mL başına 0.6 x10 6 hücrede süspansiyon halindetutun.</li>
	<li>Plaka 1 x 10 5 Jurkat hücresi ile muamele edilmiş bir doku kültürünün oyuğu başına24 oyuklu plaka, lentiviral verimliliği artıran 4 μg / mL polibren içeren 500 μL RPMI büyüme ortamında plaka. Lazer tabanlı bir floresan algılama tezgah üstü hücre analizörü kullanarak hücreleri sayın. Kuyu sayısı, değerlendirilecek yapı sayısına bağlıdır. Bu örnekte 4 yapı ve dönüştürülmemiş bir denetim kullanılacaktır. CAR yapı tasarımı Tablo 1'de gösterilmektedir.</li>
	<li>Her CAR yapısından 10 μL lentivirüs / kuyu ekleyin. CAR yapı tasarımı ve lentivirüs üretimi daha önceanlatıldığı gibi yapıldı 12.</li>
	<li>Ertesi gün, her bir kuyucuğa 1 mL büyüme RPMI ortamı ekleyin ve inkübatörde 37 °C'de% 5 CO2 ile kültürlemeye devam edin.</li>
	<li>Hücreleri 2 gün sonra toplayın (Jurkat transdüksiyonundan toplam 72 saat sonra) ve sayın.</li>
	<li>Jurkat hücrelerinde CAR ekspresyonunu doğrulamak için çalışan akış için 1 x 104 hücre alın. Kısaca, CAR-J'yi 4 °C'de karanlıkta 30 dakika boyunca CAR pozitifliğini tespit etmek için kullanılan Bayrak etiketini hedefleyen antikorlarla etiketlemeden önce hücreleri 2x FACS boyama solüsyonu (FSS) ile yıkayın. FSS ile tekrar 2 kez yıkayın ve hücreleri daha önce tarif edildiği gibi bir akış sitometresinden geçirin12. Üretici tarafından önerilen antikor konsantrasyonunu kullanın.</li>
	<li>Jurkat hücreleri kolayca transdüksiyona uğrar ve neredeyse her zaman %>90 CAR ekspresyonu gösterir. Ko-kültür sitotoksisite testinden çok önce CAR-J üretin ve daha sonra kullanmak üzere dondurun.</li>
</ol>2. CFSE etiketli tümör hücrelerinin kaplanması
NOT: MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26'dan) hücreleri bir işbirlikçinin hediyesiydi ve EGFR KO MDA-MB-231 daha önce açıklandığı gibioluşturuldu 12.
<ol><li>Bir T-75 şişesinde 1 x 106 hücreyi çözün ve bunları T-75 şişelerinde kültürleyin. MDA-MB-231 tümör hücrelerini ve CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 tümör hücrelerini, %10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş Dulbecco'nun modifiye kartal ortamının (DMEM) 14 mL'sinde 37 ° C'de bir inkübatörde% 5 CO2 ile koruyun ve yaklaşık% 70 birleştiğinde bölünür.</li>
	<li>Yaklaşık% 70 birleşmeyi sağlamak için düzenli parlak alan mikroskobu altında yapışık tümör hücrelerini gözlemleyin.</li>
	<li>Serolojik bir pipet kullanarak büyüme ortamını şişeden çıkarın. T75 şişesine 3 mL tripsin ekleyin ve hücreleri şişeden ayırmak için 3-5 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatöre koyun.</li>
	<li>Eşit miktarda (3 mL) büyüme ortamı kullanarak tripsini nötralize edin. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpünde toplayın ve hücreleri peletlemek için 4 dakika boyunca hücreleri 400 x g'da döndürün.</li>
	<li>Süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve hücreleri 2 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin. Bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.</li>
	<li>8 x 105 hücreyi başka bir 15 mL'lik tüpe aktarın ve 1 mL'lik bir hacme ulaşmak için PBS ekleyin.</li>
	<li>Her tüpe 2 μL karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE; 5 μM stok konsantrasyonu) ekleyin ve 1 mL'lik bir pipet kullanarak iyice karıştırın.</li>
	<li>Hücreleri CFSE ile inkübatörde 20 dakika boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin. Tüpleri 20 dakika sonra inkübatörden çıkarın ve tüpe 5 mL büyüme ortamı ekleyin.</li>
	<li>CFSE etiketli hücreleri peletlemek için tüpleri 400 x g'da 4 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL taze ortam ekleyin.</li>
	<li>Bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu yeniden değerlendirin. 4 x 105 hücreyi 25 mL'lik bir reaktif rezervuarına aktarın ve toplam 8 mL'lik bir hacim için ortam ekleyin.<ol><li>100 μL ortamda 5000 tümör hücresini/kuyusunu tohumlamak için yeterli hacmi sağlamak için, çok kanallı pipeti kullanarak pipetleme yapabilmek ve adım 1.7 sırasında birkaç hücre kaybını telafi etmek için hacim gerekiyordu, %10-20 ekstra hücre ve ortam hacmi hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak iyice karıştırın. 100 μL'lik çok kanallı bir pipet kullanarak, sol yarıdaki şeffaf düz tabanlı siyah 96 oyuklu plakanın her sırasına 100 μL hücre süspansiyonu pipetleyin. Örnek bir kaplama stratejisi Tablo 2'de bulunabilir.</li>
	<li>EGFR KO hücrelerini benzer şekilde plakanın sağ yarısına pipetleyin. Tüm plaka kaplandıktan sonra, tümör hücrelerinin oyuklarda eşit dağılımını sağlamak için plakayı doku kültürü başlığı platformunda ileri geri ve yan yana sürükleyin.</li>
	<li>Tümör hücrelerinin tutunması için plakayı inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 ile 4 saat inkübe edin.</li>
</ol>3. Jurkatları CFSE etiketli tümör hücreleri ile eksprese eden CAR'ın birlikte kültürlenmesi
<ol><li>Transdüksiyonsuz ve CAR eksprese eden Jurkat hücrelerinin sayımlarını kullanarak, her bir CAR-J'nin 4 x 105 hücresini 25 mL'lik bir rezervuara aktarın. Toplam 2 mL hacim için DMEM büyüme ortamı ekleyin.</li>
	<li>4:1 E:T için, bağlı tümör hücrelerini rahatsız etmemek için her bir oyuğun kenarı boyunca nazikçe çok kanallı bir pipet kullanılarak 100 μL ortamda oyuk başına 2 x 104 CAR-J ilave edildi.</li>
	<li>Tümör hücreleri ve Jurkat hücreleri içeren kuyucukların kenarına çok kanallı bir pipet kullanarak 100 μL daha büyüme ortamı ekleyin. Sadece tümör grupları, tüm oyuklarda toplam 300 μL ortam yapmak için 200 μL ortam alır.</li>
	<li>Jurkat hücrelerinin tümör hücreleri üzerinde eşit dağılımını sağlamak için plakayı platform boyunca ileri geri ve yan yana hareketlerle sürükleyin.</li>
	<li>İnkübatörde 37 °C'de 48 saat boyunca% 5 CO2 ile kokültüre izin verin.</li>
</ol>4. Görüntüleme için plakanın hazırlanması
<ol><li>Kuyucuk sayısına bağlı olarak düşük arka plan floresan ortamında 1 μg/mL'de bir propidyum iyodür (PI) çözeltisi yapın ve her biri 100 μL ortam elde edin.</li>
	<li>84 kuyu için PI içeren 9 mL ortam hazırlayın. Ortamı bir pipet kullanarak iyice karıştırın.</li>
	<li>Triton-X'i deiyonize su ile seyrelterek 10 mL %20 Triton-X çözeltisi yapın. 48 saatlik kokültürden sonra, CAR-J içeren süpernatanı, plakanın tek bir ters çevrilmesiyle ve kağıt havluya hafifçe vurarak atın.</li>
	<li>Şimdi, yapışan tümör hücrelerini rahatsız etmemek için çok kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa PI içeren 100 μL yukarıda hazırlanmış ortam (adım 4.2) ekleyin.</li>
	<li>Her tümör tipinin ilk kuyucuğuna 20 μL% 20 Triton-X çözeltisi ekleyin, bu da toplam ölü kontrol işlevi görür.</li>
	<li>Plakayı inkübatörde 20 dakika bekletin. Floresan görüntüleme sitometresini kullanarak plakayı görüntüleyin. Veriler bilgisayarda saklanır ve daha sonra analiz edilebilir.</li>
</ol>5. Floresan görüntülerin analizi
<ol><li>Yeşil floresan kanalını ayarlamak için tümör hücrelerinden birini kullanın.</li>
	<li>Kuyu kenarındaki hücreleri çıkarmak için kuyu maskesini %98'e düşürün, çünkü sinyal kenarda mükemmel değildir.</li>
	<li>Yeşil, floresan CFSE kanalındaki CFSE etiketli tümör hücrelerini tanımlayın. Kuyudaki tüm hücreleri almak için floresan yoğunluğu eşik değerini değiştirin.</li>
	<li>CFSE kanalında tespit edilen kalıntıları temizlemek için minimum hücre çapını 25 μm'ye ayarlayın. Bu, analiz edilen hücre tipine bağlı olarak değişir.</li>
	<li>Birbirleriyle temas halinde olduklarında tek tek hücreleri tanımlamak için Ayrı Dokunma Nesneleri'ni etkinleştirin.</li>
	<li>Görüntü ekranında CFSE'yi seçin ve sistem tarafından neyin seçildiğini anlamak için grafik kaplamaya bakın.</li>
	<li>CFSE etiketli hücreler düzgün bir şekilde alındıktan sonra, canlı ve ölü hücre popülasyonunu tanımlamak için kapılar ayarlayın.</li>
	<li>CFSE etiketli hücreleri seçerek, y ekseninde ve x ekseninde ortalama PI yoğunluğuna karşı bir sayım histogramı oluşturun.</li>
	<li>Triton-X'i eklediğimiz kuyuya dayanarak (adım 4.5), düşük PI lekeli ve yüksek PI lekeli hücreleri ayırt etmek için bir ayırıcı çizin. Bu kuyu, yüksek PI lekeli bir bölgede hücrelerin çoğuna sahip olmalıdır. NOT: PI, canlı hücrelerde bazal sinyal gösterir. Bu nedenle, Triton-X eklemek tüm hücreleri öldürür ve kırmızı floresan kanalında parlak bir şekilde boyanırlar. Bu, ölü hücreleri canlı hücrelerden ayırmak için kapıların çizilmesini kolaylaştırır.</li>
	<li>Hücreleri daha iyi görüntüleyebilmek için x ekseni değerini ayarlayın. Şimdi düşük PI lekeli hücreleri Canlı hücreler olarak etiketleyin.</li>
	<li>Canlı hücreleri seçerek, x ekseninde alan ve y ekseninde sayılan başka bir histogram ayarlayın.</li>
	<li>Enkazı değil, hücreleri yakalamak için tümörü iyi kullanarak başka bir ayırıcı çizin. Jurkat ile muamele edilmiş kuyular, CFSE lekelenecek ve sayımlardan çıkarılması gereken enkaz biriktirmeye başlayacaktır. Kalan enkaz olmayanlar "Büyük hücreler" olarak etiketlenir.</li>
	<li>Analizi tüm plaka üzerinde çalıştırın ve sayıları içeren elektronik tabloyu dışa aktarın.</li>
	<li>CAR-J'ye maruz kaldıktan sonra kuyuda kalan canlı CFSE etiketli tümör hücrelerinin sayısını belirlemek için Büyük sayıları çizin. Tek yönlü ANOVA kullanarak istatistikleri belirleyin.</li>
</ol>

CAR İfade Eden Jurkat Hücreleri ile Kantitatif Tümör Hücresi Öldürmenin Değerlendirilmesi

<ol>
	<li>Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+bench+to+bedside:+the+history+and+progress+of+CAR+T+cell+therapy.">From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy.</a> Front Immunol. 14, 1188049 (2023).</li><li>Labanieh, L., Mackall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+immune+cells:+design+principles,+resistance+and+the+next+generation.">CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation.</a> Nature. 614, 635-648 (2023).</li><li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cell+therapy:+current+limitations+and+potential+strategies.">CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).</li><li>Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 167, 81-98 (2022).</li><li>Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+assays+to+measure+CAR+T-cell-mediated+cytotoxicity.">Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).</li><li>Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EBV-genome+negative+&amp;#34;null&amp;#34;+and+&amp;#34;T&amp;#34;+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma.">Characterization of EBV-genome negative &amp;#34;null&amp;#34; and &amp;#34;T&amp;#34; cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).</li><li>Abraham, R. T., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jurkat+T+cells+and+development+of+the+T-cell+receptor+signalling+paradigm.">Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm.</a> Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).</li><li>Bloemberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+characterizing+novel+chimeric+antigen+receptors+in+Jurkat+cells.">A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).</li><li>Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+tumor+antigen-specific+single-chain+variable+fragments+using+a+chimeric+antigen+receptor+bicistronic+retroviral+vector+in+a+Mammalian+screening+protocol.">Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol.</a> Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).</li><li>Alonso-Camino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARbodies:+Human+antibodies+against+cell+surface+tumor+antigens+selected+from+repertoires+displayed+on+T+cell+chimeric+antigen+receptors.">CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).</li><li>Jahan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Jurkat+reporter+T+cell+line+for+evaluating+the+functionality+of+novel+chimeric+antigen+receptors.">Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors.</a> Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).</li><li>Subham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+as+a+potent+CAR+T+target+in+triple+negative+breast+cancer+brain+metastases.">EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases.</a> Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).</li><li>Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D., Maus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+Design+of+Chimeric+Antigen+Receptors.">Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li><li>Shan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+PTEN+in+Jurkat+T+cells+causes+constitutive+localization+of+Itk+to+the+plasma+membrane+and+hyperresponsiveness+to+CD3+stimulation.">Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation.</a> Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).</li><li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+signaling+roles+of+CD3&#949;+and+its+application+in+CAR-T+cell+therapy.">Multiple signaling roles of CD3&#949; and its application in CAR-T cell therapy.</a> Cell. 182 (4), 855-871 (2020).</li><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma-targeted+CD4++CAR+T+cells+mediate+superior+antitumor+activity.">Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity.</a> JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).</li><li>Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening+assay+to+identify+agents+that+enhance+T-cell+recognition+of+human+melanomas.">A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas.</a> Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).</li><li>Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+media+for+fluorescence+imaging:+Striking+the+right+balance+between+signal+strength+and+long-term+cell+health.">Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health.</a> Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).</li><li>. Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing">https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing</a> (2023)</li><li>Kessel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+3D+tumor+spheroid+screening+method+for+cancer+drug+discovery+using+celigo+image+cytometry.">High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry.</a> SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Burada, Jurkat hücrelerinde CAR ekspresyonu tarafından indüklenen hedefe özgü sitolitik aktiviteyi verimli bir şekilde değerlendirmek için hızlı bir yöntem önerdik. Tüm CAR yapıları aynı scFv'ye sahiptir, ancak CAR-T hücrelerinin potensini etkilediği gösterilen farklı menteşe ve transmembran alanları13. Bu CAR-J tarafından spesifik olmayan öldürmenin daha ileri değerlendirmesi, antijen nakavt (KO) hücreleri ile kültürlenerek yapıldı. Bu, öldürmenin tümör antijeni...

CAR-T hücre tedavisi, Ulusal Kanser Enstitüsü6 tarafından bildirildiği üzere, 2017'den bu yana 1 FDA onaylı CAR-T ürününden de anlaşılacağı gibi, hematolojik malignitelerde büyük umut vaat etmektedir. Katı tümörleri hedeflemek için klinik çalışmalarda çok sayıda CAR-T hücresi vardır. Yeni CAR hedeflerinin mühendisliği ve CAR yapısının optimize edilmesi, bir CAR-T hücresinin etkinliği için hayati önem taşır. Her uygulama için ideal CAR yapısının seçilmesi, normal dokularda düşük TAA ekspresyon seviyelerinden kaçınırken, tümörle ilişkili antijenlerin (TAA) doğru hedeflenmesi için gereklidir2.
Bir CAR yapısı temel olarak beş bölmeden oluşur: (1) tümör antijenini hedefleyen hücre dışı tek zincirli değişken fragman (scFv) alanı; (2) menteşe alanı; (3) transmembran alanı; (4) hücre içi sitoplazmik T hücresi uyarıcı alanı; ve (5) sinyal alanı. Bu alanların her birinin değiştirilmesi, hedef hücresi3 ile etkileşime giren CAR-T hücresinin hassasiyetini etkiler. Bu nedenle, bu CAR yapılarının sitotoksisitesini ve çapraz reaktivitesini in vitro olarak değerlendirmek, in vivo deneylere doğru ilerlemek için doğru yapıyı seçmek için kritik öneme sahiptir. T hücreleri tarafından sitolizi değerlendirmenin mevcut yöntemleri arasında 51Cr salım testi, laktat dehidrojenaz salım testi, biyolüminesan görüntüleme testi, gerçek zamanlı empedans tabanlı hücre analizi ve hücre bazlı akış sitometrisi testi 4,5 bulunur. Burada açıklanan floresan görüntüleme tabanlı platform, T hücreleri tarafından sitolizi değerlendirmenin dolaylı bir yönteminin aksine, T hücresi sitolizinin doğrudan bir miktar tayini olan canlı ve ölü hücrelerin sayısını tanımlar.
İşte MDA-MB-231 üçlü negatif meme kanseri (TNBC) hücrelerine karşı epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) CAR eksprese eden Jurkat hücrelerinin sitotoksisitesini değerlendirmek için minimum müdahale ile kolay, uygun maliyetli, hızlı ve yüksek verimli bir tekniktir ve EGFR CRISPR MDA-MB-231 hücrelerini devre dışı bırakır. Jurkat hücreleri, T hücresi aktivasyonunu ve sinyal mekanizmalarını incelemek için yaygın olarak kullanılanölümsüzleştirilmiş insan T Lenfosit Hücreleri6'dır 7. Ayrıca, Jurkat hücreleri, çoklu çalışmalarda in vitro CAR testi için kullanılmıştır 8,9,10,11. Jurkat hücreleri, lentivirüs tarafından kolayca transdüksiyona sahiptir ve sürekli proliferasyona sahiptir ve bu sistem, çeşitli EGFR CAR yapılarının menteşe alanını optimize etmek için kullanılmıştır.
Bu test, çeşitli tümör antijenlerini hedef alan çoklu CAR yapılarını taramak için kullanılabilir ve çoklu yapışık tümör hücre hatlarına karşı ve çeşitli efektör/tümör (E:T) oranlarında kullanılabilir. Ek olarak, birden fazla zaman noktası değerlendirilebilir ve çeşitli CAR yapıları arasında en iyi öldürmeyi belirlemek için kopya sayısı değiştirilebilir. En iyi yapıların, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) türetilen CD3 T hücreleri kullanılarak doğrulanması gerekir. Bu yöntemin geliştirilmesinin arkasındaki genel amaç, düşük iletim verimliliği gibi engellerin üstesinden gelerek CAR menteşe geometrisini yüksek verimli bir şekilde hızla optimize etmek ve ardından PBMC'den türetilen T hücrelerinde onay almaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube (Sterile)</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>#C15B</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube (Sterile)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black/Clear 96 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353219</td>
			<td>Celligo has a list of compatible plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter</td>
			<td>Nexcelcom Bioscience</td>
			<td>200-BFFL-5C</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo Software</td>
			<td>Nexcelcom Bioscience</td>
			<td>Version 5.3.0.0</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HeraCell 160i</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>13-0850-U500</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Cytek</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-040</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini bio-products</td>
			<td>900-108</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Cytek, BD, etc</td>
			<td>Aurora, LSR II, etc</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Sortware</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Company&#160;</td>
			<td>Version 10.7.1</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorobrite DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 9.3.1 (471)</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichanel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Finnpipette F2</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-031</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)</td>
			<td>Pr1ma</td>
			<td>PR-1250RK-FL, etc</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Finnpipette F2</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-041-cv</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette Aid</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-105</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes (Sterile, various sizes)</td>
			<td>Pr1ma</td>
			<td>PR-SERO-25, etc</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Reservoirs</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>RESE-2000</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Any similar will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vitro cytotoxicity evaluation of jurkat expressing chimeric antigen receptor using fluorescent imaging

Kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri onkolojinin ön saflarında yer alır. Bir CAR, eşlik eden bir zincir içi bağlayıcı ve ardından bir menteşe, transmembran ve yardımcı uyarıcı alan ile bir hedefleme alanından (genellikle tek zincirli değişken bir parça, scFv) oluşur. Zincir içi bağlayıcı ve menteşe alanının değiştirilmesi, CAR aracılı öldürme üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bir CAR yapısının her bir parçası için birçok farklı seçenek göz önüne alındığında, çok sayıda permütasyon vardır. CAR-T hücreleri yapmak zaman alıcı ve pahalı bir süreçtir ve birçok yapıyı yapmak ve test etmek ağır bir zaman ve malzeme yatırımıdır. Bu protokol, Jurkat hücrelerinde (CAR-J) menteşe için optimize edilmiş CAR yapılarını hızlı bir şekilde değerlendirmek için bir platformu açıklar. Jurkat hücreleri, verimli CAR transdüksiyonuna izin veren, yüksek lentivirüs alımına sahip ölümsüzleştirilmiş bir T hücre hattıdır. Burada, bir floresan görüntüleyici kullanarak CAR-J'yi hızlı bir şekilde değerlendirmek için bir platform sunuyoruz, ardından PBMC'den türetilen T hücrelerinde sitolizin doğrulanması geliyor.

CAR-T cell therapy has shown great promise in hematological malignancies, evident from the 6 FDA-approved CAR-T products since 2017, as reported by the National Cancer Institute1. There are numerous CAR-T cells in clinical trials for targeting solid tumors. Engineering novel CAR targets and optimizing the CAR construct is vital to the efficacy of a CAR-T cell. Choosing the ideal CAR construct for each application is essential for accurate targeting of tumor associated antigens (TAA) while avoiding low levels of TAA expression in normal tissues2.
A CAR construct is primarily made of five compartments: (1) extracellular single-chain variable fragment (scFv) domain targeting tumor antigen; (2) hinge domain; (3) transmembrane domain; (4) intracellular cytoplasmic T cell costimulatory domain; and (5) signaling domain. Modifying each of these domains affects the precision of the CAR-T cell engaging with its target cell3. Hence, evaluating the cytotoxicity and cross-reactivity of these CAR constructs in vitro is critical to choose the right construct for progressing toward in vivo experiments. Current methods of evaluating cytolysis by T cells include 51Cr release assay, lactate dehydrogenase release assay, bioluminescent imaging assay, real-time impedance-based cell analysis, and cell-based flow cytometry assay4,5. The fluorescent imaging-based platform described here identifies the number of live vs. dead cells, which is a direct quantification of T cell cytolysis as opposed to an indirect method of evaluating the cytolysis by T cells.
Here is an easy, cost-efficient, rapid, and high throughput technique with minimal intervention to evaluate the cytotoxicity of Jurkat cells expressing epidermal growth factor receptor (EGFR) CAR against MDA-MB-231 triple-negative breast cancer (TNBC) cells and EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231 cells. Jurkat cells are immortalized human T Lymphocyte Cells6 that have been widely used for studying T cell activation and signaling mechanisms7. Furthermore, Jurkat cells have been used for in vitro CAR testing in multiple studies8,9,10,11. Jurkat cells are easily transduced by lentivirus and have sustained proliferation, and this system was leveraged to optimize the hinge domain of various EGFR CAR constructs.
This assay can be used for screening multiple CAR constructs targeting various tumor antigens and used against multiple adherent tumor cell lines and in various effector to tumor (E:T) ratios. Additionally, multiple time points can be evaluated, and number of replicates can be modified to identify best killing among the various CAR constructs. The best constructs need to be confirmed using peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) derived CD3 T cells. The overall goal behind developing this method is to rapidly optimize CAR hinge geometry in a high throughput manner overcoming barriers such as low transduction efficiency, followed by confirmation in PBMC derived T cells.

Yazar Spotlight: Gelişmiş sitotoksisite ve immünolojik hafıza için CAR T-hücresi yapılarının yüksek verimli taraması 

Floresan Görüntüleme Kullanılarak Jurkat Eksprese Eden Kimerik Antijen Reseptörünün Hızlı İn Vitro Sitotoksisite Değerlendirmesi

CAR T-cells are being constantly improved to achieve better responses in human clinical trials. We are identifying ways to evaluate this in our lab using an unbiased high throughput method, such as using fluorescent imaging to screen combinations that work best. There are several combinations of constructs that can be designed for any single chain variable fragment by modifying the geometry of the extracellular and hinge domains.We have designed this protocol to identify the combinations with the best efficacy in eliminating target cells using Jurkat cells. This is a rapid, high throughput protocol to screen CAR constructs based on its target cell cytotoxicity using Jurkat cells, which are then validated with conventional T-cells. A dozen different CAR constructs can be tested in a 96-well plate simultaneously using this technique.Here in Akhavan Lab, we quantify in absolute numbers the direct cyclosis of target cells by the CAR expressing Jurkat cells in a high throughput manner to screen multiple CAR constructs. Our laboratory's primary aim is to improve the clinical translation of CAR T-cell therapy against high grade brain tumors. We leverage high throughput drug screens as one modality to improve CAR T-cell cytotoxicity, as well as targeting the tumor microenvironment.

CAR-J1 için 1: 8 ile 8: 1 arasında bir E: T oranı aralığı, TNBC MDA-MB-231 hücrelerinde EGFR'yi hedefleyen 72 saatte değerlendirildi. Jurkat hücreleri, adım 2'de tarif edildiği gibi CAR-J hücreleri oluşturmak için polibren ile CAR lentivirüsü ile transdüksiyona tabi tutuldu. CAR-J1'in sitotoksisitesi, 1: 8 oranında öldürmede hiçbir fark olmaksızın daha yüksek E: T oranı ile önemli ölçüde artmıştır (Şekil 1). 72 saat boyunca 4:1 E:T'de %50'den fazla öldürme ...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Screening of CAR T-Cell Constructs for Enhanced Cytotoxicity and Immunologic Memory at JoVE.com

Tek tümör antijenini hedefleyen kimerik antijen reseptörü (CAR) eksprese eden Jurkat hücreleri tarafından kantitatif tümör hücresi öldürmesini değerlendirmek için bir protokol. Bu protokol, periferik kandan türetilen T hücrelerinde onaylanmadan önce CAR menteşe yapılarının hızlı optimizasyonu için bir tarama platformu olarak kullanılabilir.

Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are at the forefront of oncology. A CAR is constructed of a targeting domain (usually a single chain variable ...

CAR T hücreleri, insan klinik deneylerinde daha iyi yanıtlar elde etmek için sürekli olarak geliştirilmektedir. Bunu, en iyi sonucu veren kombinasyonları taramak için floresan görüntüleme kullanmak gibi tarafsız bir yüksek verimli yöntem kullanarak laboratuvarımızda değerlendirmenin yollarını belirliyoruz. Hücre dışı ve menteşe alanlarının geometrisini değiştirerek herhangi bir tek zincirli değişken parça için tasarlanabilen çeşitli yapı kombinasyonları vardır.Bu protokolü, Jurkat hücrelerini kullanarak hedef hücreleri ortadan kaldırmada en iyi etkinliğe sahip kombinasyonları belirlemek için tasarladık. Bu, daha sonra geleneksel T hücreleri ile doğrulanan Jurkat hücrelerini kullanarak hedef hücre sitotoksisitesine dayalı olarak CAR yapılarını taramak için hızlı, yüksek verimli bir protokoldür. Bu teknik kullanılarak bir düzine farklı CAR yapısı aynı anda 96 oyuklu bir plakada test edilebilir.Burada Akhavan Laboratuvarı'nda, birden fazla CAR yapısını taramak için yüksek verimli bir şekilde Jurkat hücrelerini eksprese eden CAR tarafından hedef hücrelerin doğrudan siklozunu mutlak sayılarla ölçüyoruz. Laboratuvarımızın birincil amacı, yüksek dereceli beyin tümörlerine karşı CAR T-hücre tedavisinin klinik çevirisini iyileştirmektir. CAR T hücresi sitotoksisitesini iyileştirmenin yanı sıra tümör mikro çevresini hedeflemek için bir yöntem olarak yüksek verimli ilaç ekranlarından yararlanıyoruz.

rapid-vitro-cytotoxicity-evaluation-jurkat-expressing-chimeric

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Rapid In Vitro Cytotoxicity Evaluation of Jurkat Expressing Chimeric Antigen Receptor using Fluorescent Imaging

1.6K Görüntüleme.  University of Kansas Cancer Center. CAR T hücreleri, insan klinik deneylerinde daha iyi yanıtlar elde etmek için sürekli olarak geliştirilmektedir. Bunu, en iyi sonucu veren kombinasyonları taramak için floresan görüntüleme kullanmak gibi tarafsız bir yüksek verimli yöntem kullanarak laboratuvarımızda değerlendirmenin yollarını belirliyoruz. Hücre dışı ve menteşe alanlarının geometrisini değiştirerek herhangi bir tek zincirli değişken parça için tasarlanabilen çeşitli yapı kombinasyonları vard...